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铁虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

[求助] 关于小鼠骨髓间充质细胞分离培养鉴定已有1人参与

1.4 供体小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养
① B/L小鼠雄性4周龄颈部脱臼处死，在 75%酒精浸泡 10 min。②放置于无菌培养皿内移入超净工作台，无菌条件下取其双侧股骨与胫骨，在装有DMEM/F12 的培养皿内将骨表面附有的肌肉及肌筋膜等剔除干净，两端剪断暴露骨髓腔。③ 5ml注射器穿刺干骺端，用 DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔直至冲出液清亮为止，收集冲洗下来的骨髓细胞悬液于无菌离心管中，充分吹打混匀后制成单细胞悬液。1000 r /min 离心5 min，弃上清，以含 10 %胎牛血清的DMEM/F12 完全培养基重悬细胞，接种至6cm塑料培养皿，置于37 ℃、5 % CO2、饱和湿度培养箱中培养。48h 后，弃除悬浮细胞，加入新鲜培养基继续培养，2－3d 换液1 次，至贴壁细胞80%-90%融合后（大概1周），以含0.01%EDTA 的0.25％胰蛋白酶消化，进行传代培养。
1.5 MSC的传代培养及细胞形态学观察
每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态和贴壁情况。
原代细胞生长达80%~90%时，吸净培养瓶中的液体， PBS洗涤 2次，取 37℃预热过的 0.25 %胰酶 1mL，于 37℃恒温消化 2min。镜下观察细胞见细胞从梭形变为圆形，以 10%胎牛血清的 DMEM培养基终止消化，吹打细胞，使细胞完全从培养瓶中脱落并吹打成单细胞悬液。吸取细胞悬液至 15 mL的离心管中， 1 000 r/min离心 5 min，移去上清，见离心管底部一层白色沉淀，加入 DMEM/F12培养液，制成单细胞悬液。原代细胞按 1:2比例传代培养。
问题：细胞已传至第二代（培养时间10天），但发现生长缓慢，不知道是什么原因导致。
而且那细胞形态不知道是不是MSC呀，有老师说大部分都不是MSC。我顿觉悲催呀~~有没虫友能告诉我哪些是MSC呀

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