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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 完整6000左右大质粒上定点突变一个基因，用Dpni消化的整个过程
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echochen1017

新虫 (初入文坛)

[求助] 完整6000左右大质粒上定点突变一个基因，用Dpni消化的整个过程

想在6000 左右的大质粒上定点突变一个基因，拟用DpnI消化模板，想请教大神们，这个过程怎么设计？要注意的事项是什么呢？
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1楼 2013-08-20 09:52:44
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echochen1017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-08-20 16:09:41
设计Quickchang突变引物，然后以质粒为模板，进行全质粒PCR，阳性PCR产物取20ul，直接加1ulDpnI消化模板除去模板，灭活后转化宿主细胞。

消化后需要再跑电泳纯化吗？还是消化液直接转化宿主细胞
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4楼2013-08-22 10:29:28
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wanggl2004

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-08-20 11:35:21
直接设计互补引物，用quicchange去突变，pcr产物经电泳确认直接DpnI消化后再回收，然后转化大肠杆菌，挑菌落抽质粒验证
赞一下(2人) 回复此楼
思考是行动的种子！
2楼2013-08-20 10:44:32
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-20 18:26:22
设计Quickchang突变引物，然后以质粒为模板，进行全质粒PCR，阳性PCR产物取20ul，直接加1ulDpnI消化模板除去模板，灭活后转化宿主细胞。
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3楼2013-08-20 16:09:41
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by echochen1017 at 2013-08-22 10:29:28
消化后需要再跑电泳纯化吗？还是消化液直接转化宿主细胞...

我们是消化液直接转化宿主细胞。
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5楼2013-08-22 10:51:50
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