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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » ni柱纯化问题
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929519755

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-14 13:15:55
鸡鸣不已: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-08-14 14:50:41
我也用过金斯瑞的Ni-IDA，说明书上说可以挂20mg，我用过1ml的Ni纯化 到了十几毫克的蛋白。你可以把样品和Ni过夜结合，最好在4℃，而且要振摇使Ni悬浮。还有，如果你是过离子交换的，高盐不利于Ni与蛋白的结合。过夜结合，杂蛋白可能较多，你漂洗的时候可以较大咪唑浓度。不如说20  30  40
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想你没话说
11楼2013-08-14 12:39:07
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 929519755 at 2013-08-14 12:39:07
我也用过金斯瑞的Ni-IDA，说明书上说可以挂20mg，我用过1ml的Ni纯化 到了十几毫克的蛋白。你可以把样品和Ni过夜结合，最好在4℃，而且要振摇使Ni悬浮。还有，如果你是过离子交换的，高盐不利于Ni与蛋白的结合。过夜 ...

样品和Ni过夜结合还是样品和ni柱？不是说需要一定氯化钠吗？我用的是300mM的Nacl，高吗？
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12楼2013-08-14 13:53:51
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 929519755 at 2013-08-14 12:39:07
我也用过金斯瑞的Ni-IDA，说明书上说可以挂20mg，我用过1ml的Ni纯化 到了十几毫克的蛋白。你可以把样品和Ni过夜结合，最好在4℃，而且要振摇使Ni悬浮。还有，如果你是过离子交换的，高盐不利于Ni与蛋白的结合。过夜 ...

我用低浓度洗脱就可以将我目的蛋白和杂蛋白一起洗下来，我可以选择梯度洗脱吗，谢谢
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13楼2013-08-14 13:55:28
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
鸡鸣不已: 金币+15, ★★★很有帮助 2013-08-14 15:07:27
其实NI柱一般是高盐挂柱效果比较好，我们实验室一般都用500mM~1M的NaCl浓度上样，同时，高盐会让核酸直接穿流，这样对下面的实验也不会造成影响。
你也可以让填料和样品在4度轻轻搅拌过夜，之后再装柱，这样结合的会比较好一些。
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14楼2013-08-14 14:17:40
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by gelois at 2013-08-14 14:17:40
其实NI柱一般是高盐挂柱效果比较好，我们实验室一般都用500mM~1M的NaCl浓度上样，同时，高盐会让核酸直接穿流，这样对下面的实验也不会造成影响。
你也可以让填料和样品在4度轻轻搅拌过夜，之后再装柱，这样结合的 ...

麻烦问一下，你们实验室用的缓冲液是tris-hcl还是磷酸盐缓冲液还是什么，我用的是50mM的磷酸二氢钠，300mM nacl溶液，谢谢
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15楼2013-08-14 14:24:45
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xuexie

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 鸡鸣不已 at 2013-08-14 11:17:40
EDTA洗脱，咪唑吧？你用的是Ni-NTA？...

嗯，是用EDTA直接洗脱的，因为是摸索性的，只想看挂柱效果。
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16楼2013-08-14 14:31:32
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by xuexie at 2013-08-14 14:31:32
嗯，是用EDTA直接洗脱的，因为是摸索性的，只想看挂柱效果。...

哦，这样伤柱的吧。谢谢
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17楼2013-08-14 14:47:12
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710713555

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1．1M,Tris-Hcl ph=9.0: 60.5g Tris 溶解到450ml水中，调节PH，然后定容至500ml；

2.  结合缓冲液（PH=7.0的磷酸钠）：3.8g磷酸三钠溶解到450ml水调节ph到7.0；

3．0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液：1.5g甘氨酸溶解到150ml水调节ph到3.0定容至200ml.

计算方法以Tris-Hcl为例：
Tris分子量为121
要求1M： 根据公式：c=n/v，n=m/M，m=nM=1*121=121g,v=1000，然后再缩小相同倍数。
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好好学习吧
18楼2013-08-14 15:34:09
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 鸡鸣不已 at 2013-08-14 14:24:45
麻烦问一下，你们实验室用的缓冲液是tris-hcl还是磷酸盐缓冲液还是什么，我用的是50mM的磷酸二氢钠，300mM nacl溶液，谢谢...

我们一般用TRIS缓冲液，磷酸缓冲液的话，一般用于离子交换柱~
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19楼2013-08-14 16:19:35
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by gelois at 2013-08-14 16:19:35
我们一般用TRIS缓冲液，磷酸缓冲液的话，一般用于离子交换柱~...

怎么正好反过来呢。呵呵，我们离子柱用tris
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20楼2013-08-14 18:49:32
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