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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心，不没于物

[求助] 自己搞定,谢谢大家

本人做的是骨骼肌组织，目的是观察核形态，确定死亡方式
要求回答者提供下列资料：
1.详细步骤
2.需要购买的试剂
3.注意事项以及实验个人心得

[ Last edited by meizhou on 2007-11-8 at 16:11 ]
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《memory》---BarbaraStreisand
1楼 2007-11-07 17:09:13
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边疆小鱼

荣誉版主 (知名作家)
所有内容已发到你邮箱,若有不明白之处,可以联系我.
每个步骤都要严格操作,尤其是时间,一定要定好,不然就会影响后面的切片及染色.
骨骼肌,相对来说比较容易,
以下是我自己做切片选择的试剂:
固定剂:甲醛:水(1:20)
脱水:50%乙醇--12小时
       70%乙醇--12小时
       85%乙醇---4小时
       95%乙醇----2.30小时
        无水乙醇---2小时
透明:二甲苯一(30分钟
       二甲苯二(30分钟)
浸蜡与包埋:温度60度以下.具体操作请看邮件.
切片前,最好将做好的蜡块冷藏一下,切出来的片在比较容易展开.
切片的要点就是,要调整好蜡块,让整个面都被切到.
展开,我采用的是30%乙醇,切片时,将载波片置于加热器上,40度左右,滴30%乙醇于玻片,将切好的蜡片展到玻片即可.

[ Last edited by 边疆小鱼 on 2007-11-7 at 19:03 ]
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2楼2007-11-07 18:38:10
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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心，不没于物
引用回帖:
Originally posted by 边疆小鱼 at 2007-11-7 18:38:
所有内容已发到你邮箱,若有不明白之处,可以联系我.
每个步骤都要严格操作,尤其是时间,一定要定好,不然就会影响后面的切片及染色.
骨骼肌,相对来说比较容易,
以下是我自己做切片选择的试剂:
固定剂:甲醛:水( ...

你给的这个网上有，这个是石蜡切片的
请看清楚后再回答 ...
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《memory》---BarbaraStreisand
3楼2007-11-07 19:13:14
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边疆小鱼

荣誉版主 (知名作家)
接上面
做好切片,放入烘箱使组织更好的固定在玻片,时间最好大于5小时.
染色步骤:
从烘箱取出切片,乘热依次放入:

二甲苯一(20分钟),

二甲苯二(20分钟),

无水乙醇(3-5分钟),
95%乙醇(3-5分钟),
85%乙醇(3-5分钟),
70%乙醇(3-5分钟)

以上步骤为脱蜡

水洗3-5分钟

苏木素(15分钟)

水洗一分钟

盐酸-酒精,小于30秒(注意,此段时间一定要控制好,时间太短,分化不完全,太长,细胞核的颜色也会褪去.

流水中冲洗40分钟,使细胞核的颜色返蓝.

95%乙醇一分钟.

伊红染色5分钟,
  
水洗一分钟,至颜色合适

晾干后,中性树胶封片.

[ Last edited by 边疆小鱼 on 2007-11-7 at 19:23 ]
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4楼2007-11-07 19:18:51
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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心，不没于物
引用回帖:
Originally posted by 边疆小鱼 at 2007-11-7 19:18:
接上面
做好切片,放入烘箱使组织更好的固定在玻片,时间最好大于5小时.
染色步骤:
从烘箱取出切片,乘热依次放入:

二甲苯一(20分钟),

二甲苯二(20分钟),

无水乙醇(3-5分钟),
95%乙醇(3-5分钟),
85%乙 ...

二甲苯一(20分钟),

二甲苯二(20分钟),

都是脱蜡步骤，如果没做过或者不懂，最好不要跟帖
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《memory》---BarbaraStreisand
5楼2007-11-07 19:26:13
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边疆小鱼

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★
meizhou(金币+4,VIP+0):辛劳费
没看清楚就跟贴,写错内容,给你制造的麻烦,在这跟你说抱歉!
不过也请你明白一点,别人跟贴是好心,采不采纳是你的问题.
另外,我的邮件既然网上有,希望你能退回,谢谢!
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6楼2007-11-07 19:49:56
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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心，不没于物
查到了一操作方法，如下 ：
蒸馏水洗涤2分钟
苏木素染色液5-10分钟（可以根据染色结果和要求调整时间)。  
  浸自来水中冲洗去多余的染色液，约10分钟。  
  蒸馏水再洗涤一遍(数秒钟)。  
  95%乙醇5秒。  
  伊红染色液染色30秒-2分钟（可以根据染色结果和要求调整时间）。  
  此时，如果需要直接观察，可以用70%乙醇洗涤2次。如需脱水、透明后封片按后续步骤进行，70%乙醇洗涤后仍可按照后续步骤进行脱水、透明和封片处理。

不知道可行否 ？买个盒子先试试看吧
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《memory》---BarbaraStreisand
7楼2007-11-07 20:00:21
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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心，不没于物
引用回帖:
Originally posted by 边疆小鱼 at 2007-11-7 19:49:
没看清楚就跟贴,写错内容,给你制造的麻烦,在这跟你说抱歉!
不过也请你明白一点,别人跟贴是好心,采不采纳是你的问题.
另外,我的邮件既然网上有,希望你能退回,谢谢!

退给你吧 ：http://blog.sina.com.cn/s/blog_4ae6a7fb01000ait.html
刚才态度不好道歉了，不过你给的确实不合适，而且都看过
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《memory》---BarbaraStreisand
8楼2007-11-07 20:06:23
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边疆小鱼

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★
meizhou(金币+5,VIP+0):不必了，以后还有很多生理病理专业问题请教您呢
谢谢.
不过,没帮上忙,还添麻烦,
我会请斑竹把金币还给你.
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9楼2007-11-07 20:09:26
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
★
meizhou(金币+1,VIP+0):HE染色不是您说的这些东西，多谢了
看看这个行吗？ 仅供参考！！！
冰冻切片ABC法步骤1)        吹干切片或晾干
2)        浸4度冷丙酮10分钟
1 洗切片    PBS/Triton 10分钟
2 2％双氧水（溶于PBS）孵育10－30分钟
3洗切片    PBS/Triton 3X5分钟
4 加封闭液10%羊血清（PBS/Triton）30-60分钟，100-400ul
5 一抗(1:400或1:1000)（溶于10%的羊血清），4度过夜，100-400ul
6洗切片    PBS/Triton 3X5分钟
7 加生物素化二抗(1:200)（溶于10%的羊血清），室温60分，100-400ul
8 准备ABC试剂，室温下15分钟
9洗切片    PBS/Triton 3X10分钟
10 ABC孵育切片30-60分钟
11洗切片   PBS/Triton 3X10分钟
12 DAB孵育切片5分钟，100-400ul
13洗切片，PBS 3X5分钟
14 苏木素衬染10秒
15洗切片，PBS 2X5分钟
16 脱水50%（2分）、70%（2分）、95%（2分）、100%（2分）乙醇
17 透明二甲苯/乙醇（2分）、100%二甲苯（5分）
18 中性树脂封片（用纱布擦净二甲苯）
溶剂配方：
PBS/Triton:   99.8mlPBS+0.2mlTriton-X100
封闭液（稀释液）：3滴羊血清（黄瓶）+10毫升（PBS/Triton）在黄色瓶中混合。
一抗(1:400) 50ul与20毫升稀释液混合 即5ul:2ml(2ul:0.8ml)
二抗（1:200）50ul与10毫升稀释液在蓝瓶中混合，即5ul:1ml(2ul:0.4ml)
ABC 2滴A至10毫升 PBS/Triton+2滴B，混匀，30分钟后使用
DAB 5毫升蒸馏水+2滴buffer stock solution，混匀，再加4滴DAB，混匀，加2滴H2O2（30%）混匀。
1%H2O2： 1ml30%H2O2溶于PBS，终体积至30毫升
TBS ： 800毫升蒸馏水，8克NaCl，0.2克KCl，3克Tris碱，用HCL调至PH为7.4，用蒸馏水定容至1升，15磅高压消毒20分钟。


或   冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片4~8m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。

免疫组化染色步骤：
        （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）
           石蜡切片脱蜡至水。
           3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
           蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
           5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
           PBS冲洗，5分钟×3次。
           滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
           PBS冲洗，5分钟×3次。
           滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
           PBS冲洗，5分钟×3次。
           显色剂显色（DAB或AEC）。
           自来水充分冲洗，复染，封片。

[ Last edited by telomerase on 2007-11-7 at 21:27 ]
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
10楼2007-11-07 21:22:55
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