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本人做的是骨骼肌组织，目的是观察核形态，确定死亡方式 要求回答者提供下列资料： 1.详细步骤 2.需要购买的试剂 3.注意事项以及实验个人心得 [ Last edited by meizhou on 2007-11-8 at 16:11 ] |
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边疆小鱼
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所有内容已发到你邮箱,若有不明白之处,可以联系我. 每个步骤都要严格操作,尤其是时间,一定要定好,不然就会影响后面的切片及染色. 骨骼肌,相对来说比较容易, 以下是我自己做切片选择的试剂: 固定剂:甲醛:水(1:20) 脱水:50%乙醇--12小时 70%乙醇--12小时 85%乙醇---4小时 95%乙醇----2.30小时 无水乙醇---2小时 透明:二甲苯一(30分钟 二甲苯二(30分钟) 浸蜡与包埋:温度60度以下.具体操作请看邮件. 切片前,最好将做好的蜡块冷藏一下,切出来的片在比较容易展开. 切片的要点就是,要调整好蜡块,让整个面都被切到. 展开,我采用的是30%乙醇,切片时,将载波片置于加热器上,40度左右,滴30%乙醇于玻片,将切好的蜡片展到玻片即可. [ Last edited by 边疆小鱼 on 2007-11-7 at 19:03 ] |
2楼2007-11-07 18:38:10
3楼2007-11-07 19:13:14
边疆小鱼
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接上面 做好切片,放入烘箱使组织更好的固定在玻片,时间最好大于5小时. 染色步骤: 从烘箱取出切片,乘热依次放入: 二甲苯一(20分钟), 二甲苯二(20分钟), 无水乙醇(3-5分钟), 95%乙醇(3-5分钟), 85%乙醇(3-5分钟), 70%乙醇(3-5分钟) 以上步骤为脱蜡 水洗3-5分钟 苏木素(15分钟) 水洗一分钟 盐酸-酒精,小于30秒(注意,此段时间一定要控制好,时间太短,分化不完全,太长,细胞核的颜色也会褪去. 流水中冲洗40分钟,使细胞核的颜色返蓝. 95%乙醇一分钟. 伊红染色5分钟, 水洗一分钟,至颜色合适 晾干后,中性树胶封片. [ Last edited by 边疆小鱼 on 2007-11-7 at 19:23 ] |
4楼2007-11-07 19:18:51
5楼2007-11-07 19:26:13
边疆小鱼
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6楼2007-11-07 19:49:56
7楼2007-11-07 20:00:21
8楼2007-11-07 20:06:23
边疆小鱼
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9楼2007-11-07 20:09:26
telomerase
至尊木虫 (著名写手)
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meizhou(金币+1,VIP+0):HE染色不是您说的这些东西，多谢了
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看看这个行吗？ 仅供参考！！！ 冰冻切片ABC法步骤1) 吹干切片或晾干 2) 浸4度冷丙酮10分钟 1 洗切片 PBS/Triton 10分钟 2 2％双氧水（溶于PBS）孵育10－30分钟 3洗切片 PBS/Triton 3X5分钟 4 加封闭液10%羊血清（PBS/Triton）30-60分钟，100-400ul 5 一抗(1:400或1:1000)（溶于10%的羊血清），4度过夜，100-400ul 6洗切片 PBS/Triton 3X5分钟 7 加生物素化二抗(1:200)（溶于10%的羊血清），室温60分，100-400ul 8 准备ABC试剂，室温下15分钟 9洗切片 PBS/Triton 3X10分钟 10 ABC孵育切片30-60分钟 11洗切片 PBS/Triton 3X10分钟 12 DAB孵育切片5分钟，100-400ul 13洗切片，PBS 3X5分钟 14 苏木素衬染10秒 15洗切片，PBS 2X5分钟 16 脱水50%（2分）、70%（2分）、95%（2分）、100%（2分）乙醇 17 透明二甲苯/乙醇（2分）、100%二甲苯（5分） 18 中性树脂封片（用纱布擦净二甲苯） 溶剂配方： PBS/Triton: 99.8mlPBS+0.2mlTriton-X100 封闭液（稀释液）：3滴羊血清（黄瓶）+10毫升（PBS/Triton）在黄色瓶中混合。 一抗(1:400) 50ul与20毫升稀释液混合 即5ul:2ml(2ul:0.8ml) 二抗（1:200）50ul与10毫升稀释液在蓝瓶中混合，即5ul:1ml(2ul:0.4ml) ABC 2滴A至10毫升 PBS/Triton+2滴B，混匀，30分钟后使用 DAB 5毫升蒸馏水+2滴buffer stock solution，混匀，再加4滴DAB，混匀，加2滴H2O2（30%）混匀。 1%H2O2： 1ml30%H2O2溶于PBS，终体积至30毫升 TBS ： 800毫升蒸馏水，8克NaCl，0.2克KCl，3克Tris碱，用HCL调至PH为7.4，用蒸馏水定容至1升，15磅高压消毒20分钟。 或 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。 免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 石蜡切片脱蜡至水。 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 PBS冲洗，5分钟×3次。 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 显色剂显色（DAB或AEC）。 自来水充分冲洗，复染，封片。 [ Last edited by telomerase on 2007-11-7 at 21:27 ] |
10楼2007-11-07 21:22:55