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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 包涵体的洗涤
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coffee159

金虫 (小有名气)

[求助] 包涵体的洗涤 已有3人参与

高手们，本人是准研一的，刚进实验室做实验。现在在做重组基因的原核表达，超声破碎细胞后用洗涤液洗包涵体，是洗掉一些膜碎片和膜蛋白吗？为什么每次洗过之后的上清和沉淀都要制样跑SDS-PAGE呢？还有，为什么包涵体跑电泳时会出现好多条带？谢谢你们了。
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1楼 2013-08-03 20:40:27
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马海云

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by Sthunder at 2014-07-22 00:41:39
上清没东西，说明可溶蛋白已经没了，接下来就过柱就好！如果你过柱后所得蛋白还是多带的话，就有可能是多聚体，或者纯化过程需要改进...

恩啊 我现在找到原因了，是超声破碎次数太少，没有破碎完全。我的目的蛋白与菌体蛋白之间结合紧密，破碎次数少，没有分开所以洗的时候不容易洗下来！
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14楼2014-07-27 09:39:40
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-08-04 00:08:51
coffee159: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-08-04 08:59:42
洗涤是为了去掉其他不溶蛋白，每次跑胶是为了检测你目的蛋白，及其相对纯度。有经验后其实根本都没必要每次都检测。至于包涵体你跑出多条带，有可能是不纯，如果你没过柱，多条带是很正常的，如果过柱纯化，而且个方面都没问题的话，就考虑一下是否是二聚体和多聚体（如果你蛋白中含多个半胱氨酸的话，很有可能）。Good luck！
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互助互励，共奋共进！！
2楼2013-08-03 21:45:19
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coffee159

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-03 21:45:19
洗涤是为了去掉其他不溶蛋白，每次跑胶是为了检测你目的蛋白，及其相对纯度。有经验后其实根本都没必要每次都检测。至于包涵体你跑出多条带，有可能是不纯，如果你没过柱，多条带是很正常的，如果过柱纯化，而且个方 ...

谢谢你，还有点不明白，洗涤是为了洗掉溶解包涵体时不能溶解的蛋白？还有就是洗涤后的沉淀跑胶是检测目的蛋白，那洗涤后的上清跑胶是为了什么呢？
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3楼2013-08-04 09:02:48
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by coffee159 at 2013-08-04 09:02:48
谢谢你，还有点不明白，洗涤是为了洗掉溶解包涵体时不能溶解的蛋白？还有就是洗涤后的沉淀跑胶是检测目的蛋白，那洗涤后的上清跑胶是为了什么呢？...

包涵体是复合体，其顽固程度不同，在洗涤buffer加以超声处理过程中难免部分会被打散，溶解！
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互助互励，共奋共进！！
4楼2013-08-04 09:10:33
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