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33ggdf

新虫 (小有名气)

[交流] 双酶切连接 已有5人参与

做双酶切为以后的的连接做准备时，回收目的片段应用TBA还是TAE?为什么？我的载体和目的片段的大小比为10:1，请问我要怎么设置两者的摩尔比？连接的体系是什么？10微升还是20微升？
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1楼 2013-08-02 11:51:14
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dulei

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-08-02 16:40:08
gyesang: 回帖置顶 2013-08-02 16:40:09
回收用TAE就可以，切胶的时候尽可能快，不要紫外下暴露太长时间。片段过小或过大都会造成连接效率的下降，最佳摩尔比是1:3，可以适当放宽范围。最重要的一点是载体和片段要尽可能浓一些，这样连接效率才高。10ul体系足够。
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3楼2013-08-02 15:12:51
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普通回帖

loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-02 12:53:47
TAE缓冲液啊摩尔比1:5吧 载体少些，基因多些，10微升就够了
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我会绕一个圈，走回到实验室
2楼2013-08-02 12:24:23
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33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dulei at 2013-08-02 15:12:51
回收用TAE就可以，切胶的时候尽可能快，不要紫外下暴露太长时间。片段过小或过大都会造成连接效率的下降，最佳摩尔比是1:3，可以适当放宽范围。最重要的一点是载体和片段要尽可能浓一些，这样连接效率才高。10ul体系 ...

为什么不用TBA？
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4楼2013-08-03 20:05:32
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33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by loveskyzhou at 2013-08-02 12:24:23
TAE缓冲液啊摩尔比1:5吧 载体少些，基因多些，10微升就够了

为什么不用TBE啊？？
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5楼2013-08-04 13:15:12
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
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5楼: Originally posted by 33ggdf at 2013-08-04 13:15:12
为什么不用TBE啊？？...

TBE一般跑PAGE胶的时候用
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-08-04 17:05:08
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高洁琼

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-14 17:55:34
TAE buffer回收，载体和目的片段的摩尔比一般是1：3到1:10之间都可以。连接体系可以根据你的连接酶而定。我以前用的连接酶体系是20微升，现在换个厂家的T4连接酶，用的是15微升体系。
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Nothing~seek,nothing~find.
7楼2013-08-04 18:34:02
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)
★
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都行，失败几次就会了。这个技术是很成熟的
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8楼2013-08-05 13:39:15
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33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 高洁琼 at 2013-08-04 18:34:02
TAE buffer回收，载体和目的片段的摩尔比一般是1：3到1:10之间都可以。连接体系可以根据你的连接酶而定。我以前用的连接酶体系是20微升，现在换个厂家的T4连接酶，用的是15微升体系。

我的两个连接片段浓度约6.0纳克/微升，我配的10微升连接体系，1微升T4连接酶，1微升10倍连接buffer，其他8微升加我的两个目的片段。可就是热击转化后不长菌，我在找原因，能不能帮忙分析一下？？谢谢！！
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9楼2013-08-14 14:36:57
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