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maple032023

铜虫 (初入文坛)

[求助] P450BM3表达

从巨大芽孢杆菌中克隆P450BM3基因,表达质粒pET-22b,表达菌株E.coli BL21,重组菌构建成功,测序正确。表达体系为TB培养基加入各种金属离子,IPTG诱导表达24h,超声破碎得粗酶液SDS检测没有目的条带,用NADPH方法检测也显示没有活性。怀疑可能是没有表达出来,原因不确定。是表达质粒有问题?还是表达菌株?表达过程中我没有加氨基乙酰丙酸,是不是也有影响?

第一次做P450,请大家多多帮忙。如果有朋友做过P450BM3表达并有成熟的protocol可以跟我分享一下的话我将不胜感激。
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yinl03

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这个东西分子进化大牛F.H.Arnold实验室做得多,可以看看相关文章。
2楼2013-08-01 11:29:52
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whdxhxy

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
P450看看是不是heam依赖的,如果是heam依赖的表达蛋白时要加硫酸亚铁铵和ALA,这两个是合成heam所必须的,另外,如果是heam依赖的,表达的蛋白应该是血红色的,这样的蛋白才有活性。可以查阅相关文献看看。
3楼2013-08-02 10:19:24
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alice

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你用的什么酶切位点?测序看下,不要表达时发生移码突变了!
To be strong enough
4楼2013-08-02 14:36:44
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