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maple032023

铜虫 (初入文坛)

[求助] P450BM3表达

从巨大芽孢杆菌中克隆P450BM3基因，表达质粒pET-22b，表达菌株E.coli BL21，重组菌构建成功，测序正确。表达体系为TB培养基加入各种金属离子，IPTG诱导表达24h，超声破碎得粗酶液SDS检测没有目的条带，用NADPH方法检测也显示没有活性。怀疑可能是没有表达出来，原因不确定。是表达质粒有问题？还是表达菌株？表达过程中我没有加氨基乙酰丙酸，是不是也有影响？

第一次做P450，请大家多多帮忙。如果有朋友做过P450BM3表达并有成熟的protocol可以跟我分享一下的话我将不胜感激。
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1楼 2013-08-01 09:46:03
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yinl03

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个东西分子进化大牛F.H.Arnold实验室做得多，可以看看相关文章。
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2楼2013-08-01 11:29:52
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whdxhxy

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
P450看看是不是heam依赖的，如果是heam依赖的表达蛋白时要加硫酸亚铁铵和ALA，这两个是合成heam所必须的，另外，如果是heam依赖的，表达的蛋白应该是血红色的，这样的蛋白才有活性。可以查阅相关文献看看。
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3楼2013-08-02 10:19:24
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alice

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用的什么酶切位点？测序看下，不要表达时发生移码突变了！
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To be strong enough
4楼2013-08-02 14:36:44
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