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sars37

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[求助] 最近做回收胶浓度低，请大家来看看我的实验步骤是不是有问题。

1 制备1%浓度未加EB的琼脂糖凝胶，大孔胶。将目的基因产物20μL加入孔中，若有多个目的基因，中间要空一个上样孔。
2 电泳结束后，放入EB染色液中染色10min。
3 在紫外灯下将目的条带切下，尽量不要切到多余的胶。将切下的目的条带的胶放入1.5ml EP管中。
4 空管事先称好重量，装胶后称重，得出胶重，按照QIANGEN试剂盒说明，提取目的基因。
5 目的基因片段在100—1000bp之间，加入三倍体积QXI试剂，即胶重0.1g，则QXI加0.3ml。
6 加入QXII试剂10ul，振荡30s。QXII在加样之前要充分振荡。
7 将加好样的EP管放入50℃水浴锅中，以溶解胶结合DNA，总共10min。需要每2min振荡1次，共5次。并观察颜色是否仍为黄色。
8 室温离心，13000rpm，30s，枪吸掉上清液。
9 加500μLQXI buffer 清洗，振荡，离心，室温，13000rpm，30s。枪吸掉上清液。
10 加500μL PE buffer 清洗，振荡，离心，室温，13000rpm，30s。枪吸掉上清液。
11 重复用 PE buffer清洗一次。吸净上清液，室温干燥至沉淀变白。
12 加15μL 灭菌ddH2O，振荡，混匀，室温放置5min。
13 离心，室温，13000rpm，30s，将上清移至新管中，即得提纯的目的基因.
再请教一下，如果要回收胶的话，做胶的TBE需要用EDTA调PH吗？
还有一个问题是，T4连接之后，在转化到感受态细胞之前，是不是要有一个酒精沉淀DNA的步骤？

[ Last edited by sars37 on 2013-7-24 at 15:19 ]

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