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求助，考马斯亮蓝方程，谢谢！
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| 大家好！请问：有没有考马斯亮蓝测定蛋白浓度标准曲线方程，现在急用，非常感谢！ |
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myprayer
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
wizardfan: 金币+5, 感谢详细解答 2013-07-21 08:00:27
wizardfan: 金币+5, 感谢详细解答 2013-07-21 08:00:27
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以下是具体的原理以及操作步骤： 楼主如果是要用酶标仪的话要注意：把试剂量给等比列缩小，因为酶标仪上的96孔板体积比较小，不能超过1ml总体积，还有振荡的时候最好再配置好试剂之后在摇床上混匀，不然酶标仪上会溢出。 考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 考马斯亮蓝染色法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。 试剂与器材 一、试剂 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。 二、标准和待测蛋白质溶液 1．标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。 2．待测蛋白质溶液。 人血清，使用前用0.15mol/L NaCl稀释200倍。 三、器材 试管1.5×15cm（×6），试管架，移液管管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒温 水浴；分光光度计。 操作方法 一、制作标准曲线 取7支试管，按下表平行操作。 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 标准蛋白溶液（mL） 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.15mol/L NaCl（mL） 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 考马斯亮蓝试剂（mL） 5mL 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色 A595nm 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 二、未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。 注意事项 在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 |
4楼2013-07-20 10:59:03
cicelyzh
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