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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌总蛋白看不到目的条带
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田甜思

新虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌总蛋白看不到目的条带

最近在做重组蛋白的表达，首先我想看我的目的蛋白有没有表达，加了几个 对照样，有marker ，空载体BL21，经诱导和未诱导的菌体，但是看不出明显的条带。之后为了进一步确定我的蛋白有没有表达，我又做了纯化，纯化之后条带很明显，而且是单一条带。可是为什么菌体总蛋白看不出来呢？希望大家帮着解决下
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1楼 2013-07-16 08:13:25
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为了提高外源基因的表达水平，解决方案如下：
（1）表达质粒的优化和设计：构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG 与 SD 序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻译效率有显著影响，具体表现为：SD序列 UAAGGAGG的翻译效率要比 AAGGA 高3-6倍；翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG的最适距离是6-8个碱基长度，与 AAGAA 的最适距离是5-7个碱基长度；ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3-4个碱基，与 AAGAA 至少相隔5 个碱基mRNA 的翻译才能进行；ATG与SD序列之间的碱基组成为A，T 碱基丰富时，mRNA 翻译效率较高。其次，尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中 A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’ 端形成的“茎环”结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。在必要的情况下，还可通过定点突变，PCR 等技术改变个别关键的碱基来破坏mRNA 5’端的“茎环”结构。把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因 5’端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下。再者，在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征和特点，注意引入翻译增强子序列。（2）共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因：由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度有正比关系稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。可采用1.通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子；2.在表达系统中共表达稀有密码子tRNA 基因，以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子 tRNA 的丰度。（3）提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性：利用蛋白转运系统把目标蛋白最终累积在周质空间，或分泌到培养基中；采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌；对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达；共表达能提高特定目标蛋白稳定性的辅助因子，如分子伴侣基因；对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进行改造；在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。（4）高密度发酵和工程化宿主细胞：：大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种。工程化宿主细胞：1.构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌是解决高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培养基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用的根本途径。利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白基因vgb 导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值；用基因敲除技术缺失大肠杆菌的磷酸转乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合成途径被阻断；改变代谢流的方向，通过共转化把枯草杆菌、酿酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS，单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因 pdc1 和乙醇脱氢酶基因 adh2 导入大肠杆菌，使丙酮酸的代谢有选择地向生成3-羟基丁酮或乙醇的方向进行。2.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：rpoH基因编码大肠杆RNA聚合酶的r32亚基，r32 亚基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力有正调控作用。rpoH 基因缺陷的突变株己经被构建，研究结果表明它能明显提高目标基因的表达水平。
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4楼2013-07-16 11:33:09
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yitonghui

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
田甜思(myprayer代发): 金币+1, 回答很好，perfect 2013-07-16 10:07:17
1.表达量比较低，纯化也是个浓缩过程，所以看到了。
2.目的条带和杂蛋白重合，并且量低，所以菌体中不太容易看到。
3.应该进一步确认你纯化出来的就是你要的蛋白，单靠电泳不可靠。
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2楼2013-07-16 08:54:58
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田甜思

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yitonghui at 2013-07-16 08:54:58
1.表达量比较低，纯化也是个浓缩过程，所以看到了。
2.目的条带和杂蛋白重合，并且量低，所以菌体中不太容易看到。
3.应该进一步确认你纯化出来的就是你要的蛋白，单靠电泳不可靠。

谢谢！但是我前面是有GST标签的呀,纯化的时候应该是一个特异性结合的过程，而且纯化后的电泳条带和我的理论值也差不多，很困惑
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3楼2013-07-16 09:25:04
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是诱导表达条件没有最优，重组蛋白表达量不高。
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5楼2013-07-16 11:51:05
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