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sycr

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR

请问各位大侠，我做植物DNA的PCR，跑电泳跑不出来是怎么回事？

片段1：（1000bp左右）
正反向引物的 Tm值都是：61.98
PCR条件：94   3min   
                 94   1min   ;  52  1min;  72  2min;   32个循环
                 72   7min      

片段2：（1400bp左右）
正向引物的 Tm值：58.39
反向引物的 Tm值：52.74
PCR条件：94   3min   
                 94   1min   ;  50/52  1min;  72  2min;   28个循环
                 72   7min   

这两个片段的引物和程序都是来自文献，但我就是做不出来。
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核酸生物学实验经验

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1楼 2013-07-11 11:16:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+6, 太详细了 2013-07-12 13:36:17
楼主的情况是不出现扩增条带，问题与解决如下：　　
PCR反应的关键环节有:1模板核酸的制备，2引物的质量与特异性，3酶的质量及， 4PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　
1.模板：(1)模板中含有杂蛋白质，(2)模板中含有Taq酶抑制剂，(3)模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，(4)在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。(5)模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。　　
2.酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。　　
3.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：(1)选定一个好的引物合成单位。(2)引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。(3)引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。(4)引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。　　
Mg2+ 浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。　　
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL。或100μL，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。　　
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。　　
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
一般的调整顺序：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。 然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度。再往后，重新提取DNA模板、换酶和改变反应体积。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。

过去，我也回答过PCR无产物的问题，但是这次回答做了更新。
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15楼2013-07-11 23:29:33
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-11 12:24:29
你试过用模板DNA去P其它基因吗？如果其它基因可以P出来，至少确定模板没有问题。文献上的PCR条件只能做参考，自己P的时候可能需要对退火温度做调整。
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2楼2013-07-11 11:25:27
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hotpcr

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励新虫交流 2013-07-11 12:24:41
问题有很多：
1、引物设计不正确，就像一楼说的文献上的只能做参考
2、试剂性能和你的使用上是否按说明
3、模版本身GC含量高或者含稳定二级结构，难以扩增
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我可耐的X/Y染色体啊~
3楼2013-07-11 11:55:44
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堍仔

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
变性时间可以长点，3分钟的话感觉有点短
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4楼2013-07-11 12:34:19
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sycr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-11 11:25:27
你试过用模板DNA去P其它基因吗？如果其它基因可以P出来，至少确定模板没有问题。文献上的PCR条件只能做参考，自己P的时候可能需要对退火温度做调整。

哦，ITS的P出来了。那我调整一下退火温度再试试。
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5楼2013-07-11 12:37:39
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sycr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 堍仔 at 2013-07-11 12:34:19
变性时间可以长点，3分钟的话感觉有点短

但是ITS也是这个条件，已经P出来了
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6楼2013-07-11 12:38:14
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sycr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hotpcr at 2013-07-11 11:55:44
问题有很多：
1、引物设计不正确，就像一楼说的文献上的只能做参考
2、试剂性能和你的使用上是否按说明
3、模版本身GC含量高或者含稳定二级结构，难以扩增

哦，第2点应该可以攻玉排除，其余可能有问题。但好几篇文献都是这种引物和条件，我想应该不会有太大问题吧？
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7楼2013-07-11 12:41:05
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堍仔

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主
引用回帖:
6楼: Originally posted by sycr at 2013-07-11 12:38:14
但是ITS也是这个条件，已经P出来了...

ITS是什么啊
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8楼2013-07-11 12:54:57
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堍仔

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-11 14:05:09
你不能老照着文章的来啊，PCR这个东西很多时候都说不准的，也许你今天跑出来，明天什么都一样就跑不出来了，我觉得2楼说的好，你要先试下确定你DNA没问题，然后可以试各种酶，只有你有的都试，一个一个因素来排除
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9楼2013-07-11 12:56:43
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sycr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 堍仔 at 2013-07-11 12:56:43
你不能老照着文章的来啊，PCR这个东西很多时候都说不准的，也许你今天跑出来，明天什么都一样就跑不出来了，我觉得2楼说的好，你要先试下确定你DNA没问题，然后可以试各种酶，只有你有的都试，一个一个因素来排除

哦，好的。谢谢。主要是想有针对一点的，P一次要3个小时左右，我用的是别人实验室的，不是很方便呵呵。谢谢了，我再试试
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10楼2013-07-11 13:31:10
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