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sycr

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR

请问各位大侠，我做植物DNA的PCR，跑电泳跑不出来是怎么回事？

片段1：（1000bp左右）
正反向引物的 Tm值都是：61.98
PCR条件：94   3min   
                 94   1min   ;  52  1min;  72  2min;   32个循环
                 72   7min      

片段2：（1400bp左右）
正向引物的 Tm值：58.39
反向引物的 Tm值：52.74
PCR条件：94   3min   
                 94   1min   ;  50/52  1min;  72  2min;   28个循环
                 72   7min   

这两个片段的引物和程序都是来自文献，但我就是做不出来。
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1楼 2013-07-11 11:16:33
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hotpcr

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励新虫交流 2013-07-11 12:24:41
问题有很多：
1、引物设计不正确，就像一楼说的文献上的只能做参考
2、试剂性能和你的使用上是否按说明
3、模版本身GC含量高或者含稳定二级结构，难以扩增
赞一下 回复此楼
我可耐的X/Y染色体啊~
3楼2013-07-11 11:55:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-11 12:24:29
你试过用模板DNA去P其它基因吗？如果其它基因可以P出来，至少确定模板没有问题。文献上的PCR条件只能做参考，自己P的时候可能需要对退火温度做调整。
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2楼2013-07-11 11:25:27
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堍仔

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
变性时间可以长点，3分钟的话感觉有点短
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4楼2013-07-11 12:34:19
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sycr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-11 11:25:27
你试过用模板DNA去P其它基因吗？如果其它基因可以P出来，至少确定模板没有问题。文献上的PCR条件只能做参考，自己P的时候可能需要对退火温度做调整。

哦，ITS的P出来了。那我调整一下退火温度再试试。
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5楼2013-07-11 12:37:39
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