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sycr

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR

请问各位大侠,我做植物DNA的PCR,跑电泳跑不出来是怎么回事?

片段1:(1000bp左右)
正反向引物的 Tm值都是:61.98
PCR条件:94   3min   
                 94   1min   ;  52  1min;  72  2min;   32个循环
                 72   7min      

片段2:(1400bp左右)
正向引物的 Tm值:58.39
反向引物的 Tm值:52.74
PCR条件:94   3min   
                 94   1min   ;  50/52  1min;  72  2min;   28个循环
                 72   7min   

这两个片段的引物和程序都是来自文献,但我就是做不出来。
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堍仔

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主

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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-11 14:05:09
你不能老照着文章的来啊,PCR这个东西很多时候都说不准的,也许你今天跑出来,明天什么都一样就跑不出来了,我觉得2楼说的好,你要先试下确定你DNA没问题,然后可以试各种酶,只有你有的都试,一个一个因素来排除
9楼2013-07-11 12:56:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-11 12:24:29
你试过用模板DNA去P其它基因吗?如果其它基因可以P出来,至少确定模板没有问题。文献上的PCR条件只能做参考,自己P的时候可能需要对退火温度做调整。
2楼2013-07-11 11:25:27
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hotpcr

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励新虫交流 2013-07-11 12:24:41
问题有很多:
1、引物设计不正确,就像一楼说的文献上的只能做参考
2、试剂性能和你的使用上是否按说明
3、模版本身GC含量高或者含稳定二级结构,难以扩增
我可耐的X/Y染色体啊~
3楼2013-07-11 11:55:44
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堍仔

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
变性时间可以长点,3分钟的话感觉有点短
4楼2013-07-11 12:34:19
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