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抗体偶联反应后出现260nm处紫外吸收值
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最近在做有关光敏剂（二氢卟吩e6，分子量600左右)和抗体（羊抗小鼠IgG，分子量160KD）的偶联试验，原理就是利用活化剂EDC，NHS活化光敏剂羧基，与抗体的氨基偶联，光敏剂的溶解溶剂是PBS：DMF=3:2，将光敏剂，EDC，NHS，抗体按一定比例加样反应两小时后用葡聚糖凝胶层析住洗脱，0.5ml分管收集洗脱液。 结果发现一开始的3,4管有抗体（280nm)和光敏剂（400nm)的紫外吸收，紧接着出现一段区域的洗脱液会在吸收值260nm处有相应，最后出现的是只有光敏剂的吸收带，将这两部分别小管合并后用50KD超滤离心管离心后发现，280nm处的物质全部在上管，而260nm的物质基本在下管，且280nm吸收值只有0.05左右，260nm处最大能达到1的吸收值，之前本人有单独用抗体离心后作对照，发现同浓度的抗体超滤离心后全部在上管，且280nm吸收值有1左右，我很纳闷，我加样反应后我的抗体都去哪了？只有10%都不到的的得率，且反应后260nm又是什么物质，根据超滤离心在下管可以推测分子量应该确定是小于50KD的物质，一开始我有怀疑是抗体经过反应断链了，可是我的反应条件应该没什么太大问题，况且断裂后蛋白吸收也应该在280nm左右呢。后来我为了排查柱子的原因，反应后没有过柱子直接稀释后测紫外，也发现了260nm的高吸收值，而280nm没有吸收，我推测是因为量太少可能被260nm的峰包起来了。 希望有好心的虫友帮我看看哦，我不断尝试，还换过不同公司的抗体，依旧结果照旧，谢谢大家的热心肠，小女子祝福所有虫友们一切顺心如意哦！  |
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niu199291
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4楼2022-05-09 11:56:47
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