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金虫 (小有名气)

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专业: 临床生物化学检验

[求助] 转化

做菊欧文氏杆菌的基因敲除，我把重组质粒构建好了，问题是怎么无法转化到菊欧文氏杆菌杆菌里面去，我试过三亲杂交、化学转化法、电击转化法（电压1100v 时间 2ms 5次）都不成功。求指导！包括各种方法感受态细胞的制备和转化要注意的事项或者三亲要注意的事项如果可以的话能否帮忙分析一下原因谢谢

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1楼 2013-06-27 16:22:44

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引用回帖:

4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-02 23:53:58
对你用的宿主不是很清楚。一般做电转化是在给完电激后应立即加入培养液复苏，否则会有很多死亡的。三亲接合转化主要是宿主的生长状态，菌不宜太老。接合质粒菌和helper菌最好是用过夜培养的菌液活化后使用。离心和 ...

谢！我质粒的宿主菌是大肠杆菌CC118，要转到野生型菌菊欧文氏杆菌中间去。质粒为PKNG。菊欧文氏菌生长速度较慢，我一般是第一天中午就活化它，然后大肠杆菌是过夜培养。我把三种菌在平板上划得很密，然后用接种环刮取一定量的菌株，把三种菌株混匀，置于新的LB平板上，共培养8小时及以上，但是未能得到结果！
点击完以后，我有加入SOB静置两个小时，再涂板，但是未能有菌长出！