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499649610

金虫 (小有名气)

[求助] 转化

做菊欧文氏杆菌的基因敲除，我把重组质粒构建好了，问题是怎么无法转化到菊欧文氏杆菌杆菌里面去，我试过三亲杂交、化学转化法、电击转化法（电压1100v 时间 2ms  5次）都不成功。求指导！ 包括各种方法感受态细胞的制备和转化要注意的事项 或者三亲要注意的事项   如果可以的话 能否帮忙分析一下原因 谢谢
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1楼 2013-06-27 16:22:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用的是0.2还是0.1的杯子？1100V是不是低了些？细菌一般都是2500V的。
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2楼2013-06-28 00:22:03
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499649610

金虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-28 00:22:03
你用的是0.2还是0.1的杯子？1100V是不是低了些？细菌一般都是2500V的。

0.2的
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3楼2013-07-02 14:40:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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3楼: Originally posted by 499649610 at 2013-07-02 14:40:11
0.2的...

对你用的宿主不是很清楚。一般做电转化是在给完电激后应立即加入培养液复苏，否则会有很多死亡的。三亲接合转化主要是宿主的生长状态，菌不宜太老。接合质粒菌和helper菌最好是用过夜培养的菌液活化后使用。离心和重悬操作比较温柔。
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4楼2013-07-02 23:53:58
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499649610

金虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-02 23:53:58
对你用的宿主不是很清楚。一般做电转化是在给完电激后应立即加入培养液复苏，否则会有很多死亡的。三亲接合转化主要是宿主的生长状态，菌不宜太老。接合质粒菌和helper菌最好是用过夜培养的菌液活化后使用。离心和 ...

谢！我质粒的宿主菌是大肠杆菌CC118，要转到野生型菌菊欧文氏杆菌中间去。质粒为PKNG。菊欧文氏菌生长速度较慢，我一般是第一天中午就活化它，然后大肠杆菌是过夜培养。我把三种菌在平板上划得很密，然后用接种环刮取一定量的菌株，把三种菌株混匀，置于新的LB平板上，共培养8小时及以上，但是未能得到结果！
点击完以后，我有加入SOB静置两个小时，再涂板，但是未能有菌长出！
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5楼2013-07-03 21:28:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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5楼: Originally posted by 499649610 at 2013-07-03 21:28:44
谢！我质粒的宿主菌是大肠杆菌CC118，要转到野生型菌菊欧文氏杆菌中间去。质粒为PKNG。菊欧文氏菌生长速度较慢，我一般是第一天中午就活化它，然后大肠杆菌是过夜培养。我把三种菌在平板上划得很密，然后用接种环刮 ...

我做三亲转移的时候，宿主菌和大肠杆菌都是液体培养。大肠杆菌液体培养过夜后第二天再用液体活化至对数期。离心后用无抗的LB重悬，把这两个菌1:1混合后再与宿主菌混合，宿主菌做三个稀释梯度。然后涂板。
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6楼2013-07-03 23:01:09
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499649610

金虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 23:01:09
我做三亲转移的时候，宿主菌和大肠杆菌都是液体培养。大肠杆菌液体培养过夜后第二天再用液体活化至对数期。离心后用无抗的LB重悬，把这两个菌1:1混合后再与宿主菌混合，宿主菌做三个稀释梯度。然后涂板。...

我也有试过液体培养 但是 也是一样的效果
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7楼2013-07-04 19:24:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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7楼: Originally posted by 499649610 at 2013-07-04 19:24:37
我也有试过液体培养 但是 也是一样的效果...

实在不清楚你做的宿主，你有转化菊欧文氏杆菌的文献吗？可以借鉴人家成功的方法和技巧。
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8楼2013-07-05 00:20:37
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