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499649610

金虫 (小有名气)

[求助] 转化

做菊欧文氏杆菌的基因敲除，我把重组质粒构建好了，问题是怎么无法转化到菊欧文氏杆菌杆菌里面去，我试过三亲杂交、化学转化法、电击转化法（电压1100v 时间 2ms  5次）都不成功。求指导！ 包括各种方法感受态细胞的制备和转化要注意的事项 或者三亲要注意的事项   如果可以的话 能否帮忙分析一下原因 谢谢
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1楼 2013-06-27 16:22:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 499649610 at 2013-07-02 14:40:11
0.2的...

对你用的宿主不是很清楚。一般做电转化是在给完电激后应立即加入培养液复苏，否则会有很多死亡的。三亲接合转化主要是宿主的生长状态，菌不宜太老。接合质粒菌和helper菌最好是用过夜培养的菌液活化后使用。离心和重悬操作比较温柔。
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4楼2013-07-02 23:53:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用的是0.2还是0.1的杯子？1100V是不是低了些？细菌一般都是2500V的。
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2楼2013-06-28 00:22:03
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499649610

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-28 00:22:03
你用的是0.2还是0.1的杯子？1100V是不是低了些？细菌一般都是2500V的。

0.2的
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3楼2013-07-02 14:40:11
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499649610

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-02 23:53:58
对你用的宿主不是很清楚。一般做电转化是在给完电激后应立即加入培养液复苏，否则会有很多死亡的。三亲接合转化主要是宿主的生长状态，菌不宜太老。接合质粒菌和helper菌最好是用过夜培养的菌液活化后使用。离心和 ...

谢！我质粒的宿主菌是大肠杆菌CC118，要转到野生型菌菊欧文氏杆菌中间去。质粒为PKNG。菊欧文氏菌生长速度较慢，我一般是第一天中午就活化它，然后大肠杆菌是过夜培养。我把三种菌在平板上划得很密，然后用接种环刮取一定量的菌株，把三种菌株混匀，置于新的LB平板上，共培养8小时及以上，但是未能得到结果！
点击完以后，我有加入SOB静置两个小时，再涂板，但是未能有菌长出！
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5楼2013-07-03 21:28:44
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