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wnj007881铁杆木虫 (正式写手)
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[求助]
求助能使活细胞内碱性磷酸酶升高或降低的诱导剂或抑制剂
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| 我现在做的一个荧光分子能与碱性磷酸酶结合，现在想人为调节活细胞内碱性磷酸酶含量的多少来测试荧光分子的响应，求助大家有什么诱导剂或抑制剂能改变细胞内碱性磷酸酶含量的。 |
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1949stone: MolEPI+1, 神一样的存在 2013-07-01 07:51:35
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我们可以换个角度设计实验：改变注入细胞中的荧光分子的数量与浓度，这样来测定不同数量的比例的荧光分子与细胞内的目的酶分子之间的结合状况。 可以用同步化的同种类的细胞，然后分数量与浓度梯度注入同种的的荧光分子，等适当时间后可以粉碎细胞，时间本身也可以分梯度划分，用分子筛分离分离出目的酶，用荧光光度计检测荧光强度，光谱法测定出酶的浓度，呈上体积获得目的酶的质量，然后与体外试验情况加以对比，这样可以获得一系列的原始数据。 用同步化的同种类的细胞也可以使用处于不同的细胞周期的细胞。 各种不同实验步骤的实验变量可以独立变化，总结果是相乘，可以收到的原始的实验数据会相当多。 不同的注入荧光分子的方法，不同的细胞类型，不同的荧光分子等等可以选择和调节的实验变量非常多。 |
10楼2013-06-29 19:36:34
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2楼2013-06-28 00:32:49
wnj007881
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3楼2013-06-28 14:19:49
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4楼2013-06-28 15:22:48
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5楼2013-06-28 16:37:19
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| 我觉得比较现实的办法还是用siRNA对碱性磷酸酶的表达进行RNA干涉，比较容易降低但又不是完全制止碱性磷酸酶的表达，这样可以有效地降低细胞内的碱性磷酸酶的数量。 |
6楼2013-06-28 21:07:31
wnj007881
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7楼2013-06-29 17:06:48
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-30 16:19:11
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外加抑制剂的方法，我想过，但是被我自己否决，理由：1.这种抑制剂很难说能够直接进入细胞；2.不能直接进入细胞就要显微注射，或者脂质体融合，这步本身就不比RNA干涉简单；3.及时加入了抑制剂，只是改变了酶的功能，酶分子本身依然存在，也就是失活的酶分子依然会与荧光分子发生交联；4，即使能偶找到细胞內源的目的酶的抑制多肽的基因导入细胞，这步本身就不比RNA干涉简单，而且仍然不能减少细胞内的目的酶的绝对数量，所以即使酶失活，也不能保证失活的酶分子就不与荧光分子发生交联。 所以只有使细胞内的的酶分子的绝对总数降下来，但是还存在，然后才能检测细胞内的酶分子的数量与荧光分子发生交联的情况。 而且RNA干涉是需要从数据库查阅有关基因的siRNA作用的敏感位点，而后化学合成siRNA，然后转染细胞，筛选出阳性克隆，大规模培养，导入荧光分子，总体难度并不是很大。 你要直接注射入外来的酶抑制剂，除非能够同时降解目的酶本身，否则这样设计实验没有意义，不会有结果。 |
8楼2013-06-29 17:38:57
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