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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我做了3周的载体构建了就是构建不上，求助啊
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
"酶切体系10微，基因载体是按浓度的3:1连的，然后1微的T4连接酶，1微的buffer。"
你是用T4 DNA连接酶连接的，对吧？那么很可能问题出在T4 DNA连接酶上，T4 DNA连接酶极易失活：要用新的T4 DNA连接酶；不能在室温下操作，要在冰上操作；T4 DNA连接酶加入到反应体系后，不要使用漩涡混合器混合，这将引起T4 DNA连接酶失活，用微量移液器吹打的方式混合；不能对于T4 DNA连接酶加热；反应体系小点，这样加入的T4 DNA连接酶的总量也少些，加入到反应体系的甘油也少，必要的话可用低温下透析方法去掉T4 DNA连接酶试剂中的甘油。
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21楼2013-06-25 21:11:26
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bingdong05

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

楼主详细说下你的构建转化过程，不然不好分析原因啊，若是pcr产物且是双切连接到目的载体的话，检查下：1）载体双切的两个酶距离是否过近，导致双切变成单切；2）目的序列是否酶切位点设计引物时是否添加保护碱基，若没加保护碱基，则先做TA连接，转化，挑取转化子，验证，测序，正确后再从TA载体上双切目的片段，再连接至目的载体
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22楼2013-06-28 15:36:28
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bingdong05

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 我晴天一片 at 2013-06-23 21:33:36
有条带，但是是好几条，一般做到这里我就觉得不对了，可是我提出来的到底是什么呢？？就是不知道什么原因...

质粒跑电泳几条带，一般质粒跑电泳的话出现2条或3条带
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23楼2013-06-28 15:38:46
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