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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

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"酶切体系10微,基因载体是按浓度的3:1连的,然后1微的T4连接酶,1微的buffer。"
你是用T4 DNA连接酶连接的,对吧?那么很可能问题出在T4 DNA连接酶上,T4 DNA连接酶极易失活:要用新的T4 DNA连接酶;不能在室温下操作,要在冰上操作;T4 DNA连接酶加入到反应体系后,不要使用漩涡混合器混合,这将引起T4 DNA连接酶失活,用微量移液器吹打的方式混合;不能对于T4 DNA连接酶加热;反应体系小点,这样加入的T4 DNA连接酶的总量也少些,加入到反应体系的甘油也少,必要的话可用低温下透析方法去掉T4 DNA连接酶试剂中的甘油。
21楼2013-06-25 21:11:26
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bingdong05

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

楼主详细说下你的构建转化过程,不然不好分析原因啊,若是pcr产物且是双切连接到目的载体的话,检查下:1)载体双切的两个酶距离是否过近,导致双切变成单切;2)目的序列是否酶切位点设计引物时是否添加保护碱基,若没加保护碱基,则先做TA连接,转化,挑取转化子,验证,测序,正确后再从TA载体上双切目的片段,再连接至目的载体
22楼2013-06-28 15:36:28
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bingdong05

银虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 我晴天一片 at 2013-06-23 21:33:36
有条带,但是是好几条,一般做到这里我就觉得不对了,可是我提出来的到底是什么呢??就是不知道什么原因...

质粒跑电泳几条带,一般质粒跑电泳的话出现2条或3条带
23楼2013-06-28 15:38:46
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