应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体构建
52/1返回列表
查看: 1344  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

wjw3188

木虫 (著名写手)

[求助] 表达载体构建

大家好，最近做表达出现了一点问题：首先，我将片段连接到T载体上，然后用相应酶（Bgl I 和Kpn I）酶切下来，回收后连接到载体pET-32a上，用T7引物PCR扩增，有目标条带，且单一明亮，可是提取质粒后，用同样的酶进行双酶切却切不开，不知道为什么？？？当初选择酶切位点的时候请教了别人，告诉我pET-32a上的酶切位点可以挨着，因为觉得保证载体的完整性会好一点，所以我就选择了两个挨着的酶切位点，现在切不开是不是因为这个，还是其他原因？求高手解答！！

[ 来自小组 Rose Family ]
回复此楼

» 猜你喜欢
志存高远，方能展翅高飞
1楼 2013-06-17 21:45:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by wjw3188 at 2013-06-29 11:25:02
谢谢你的回复，我的酶没有问题，我把自然克隆至T载体上，能够切下来，连接到表达载体上，无论用特异引物还是载体通用引物，都能得到目标片段，用单酶切，大小也对，用载体上其他两个酶切位点进行双酶切，竟然也是对 ...

楼主，我找到原因了，建议你看下感受态有无质粒污染，做三个对照，第一个感受态直接涂板，第二个切过后的载体和目的片段不加酶涂板，第三个切过后的载体，加酶涂板（不加目的片段）。因为回收的时候容易污染杂质粒，然后载体里面可能污染杂质粒或者切过火了，产生星号活性，连成切不开的质粒
赞一下 回复此楼
13楼2013-07-01 09:07:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wjw3188(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-18 10:52:36
酶切位点相邻的确有可能降低切割效率，不过我认为不是这个问题。因为如果你做克隆时候能切开空的pET32a载体，说明即使这两个位点相邻也能够切开。而插入目的片段后两个位点已经不相邻了，切不下来可能是你的限制酶有问题。你试试用单酶切是否能切成线性分子，比较构建载体的大小是否比空载体大。你还可以试试换其他限制酶切。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-06-18 01:02:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也是，我怀疑是甲基化问题，但我的酶不应该甲基化的，我挑了20个，大多数都切不开，我已经重新连接转化了
赞一下 回复此楼
3楼2013-06-18 13:01:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰风颤木

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主你说的问题 我也遇到了 建议你换了个酶切位点啊 我的一开始挨着也是切不开的啊。。。
赞一下 回复此楼
船到桥头自然直
4楼2013-06-20 11:05:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 化学工程085602 305分求调剂 +16 RichLi_ 2026-03-25 16/800 2026-03-26 16:18 by bruceku07
[考研] 材料科学与工程 317求调剂 +4 JKSOIID 2026-03-26 4/200 2026-03-26 15:58 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿陕师大生物学071000，298分，求调剂 +4 SYA！ 2026-03-23 4/200 2026-03-26 15:27 by caiaijun80
[考研] 化学调剂一志愿上海交通大学336分-本科上海211 +4 小鱼爱有机 2026-03-25 4/200 2026-03-26 10:19 by aa331100
[考研] 08工学调剂 +13 用户573181 2026-03-20 18/900 2026-03-25 22:00 by zbssa
[考研] 299求调剂 +7 某某某某位 2026-03-21 8/400 2026-03-25 20:34 by 热情沙漠
[考研] 一志愿中南大学化学学硕0703总分337求调剂 +7 niko- 2026-03-22 7/350 2026-03-25 20:14 by qingfeng258
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:03 by Ainin_
[考研] 网络空间安全0839招调剂 +4 w320357296 2026-03-25 6/300 2026-03-25 17:59 by 255671
[考研] 333求调剂 +6 87639 2026-03-21 11/550 2026-03-25 16:17 by 87639
[考研] 一志愿重庆大学085700资源与环境，总分308求调剂 +7 墨墨漠 2026-03-23 8/400 2026-03-23 20:36 by Creta
[考研] 328求调剂 +4 LHHL66 2026-03-23 4/200 2026-03-23 14:55 by lbsjt
[考研] 276求调剂 +3 YNRYG 2026-03-21 4/200 2026-03-23 08:31 by 醉在风里
[考研] 一志愿东华大学化学070300，求调剂 +7 2117205181 2026-03-21 8/400 2026-03-22 22:55 by chixmc
[考研] 315分，诚求调剂，材料与化工085600 +3 13756423260 2026-03-22 3/150 2026-03-22 20:11 by edmund7
[考研] 324求调剂 +6 lucky呀呀呀鸭 2026-03-20 6/300 2026-03-22 16:01 by ColorlessPI
[考研] 298求调剂一志愿211 +3 上岸6666@ 2026-03-20 3/150 2026-03-22 15:50 by ColorlessPI
[考研] 求调剂 +4 要好好无聊 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:57 by 学员8dgXkO
[考研] 295材料求调剂，一志愿武汉理工085601专硕 +5 Charlieyq 2026-03-19 5/250 2026-03-20 20:35 by JourneyLucky
[考研] 一志愿 南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕 +5 @taotao 2026-03-20 5/250 2026-03-20 20:16 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭