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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 请教一个E.coli发酵前期乙酸积累的问题
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carot

金虫 (正式写手)

[求助] 请教一个E.coli发酵前期乙酸积累的问题

从大肠杆菌接种到罐里开始到补料前的一段时间，比生长速率一般都会达到0.4-0.5，到溶氧上去这段时间乙酸浓度很容易就达到2g/L以上。
想请教一下是应该等菌体消耗一部分乙酸(即等乙酸浓度下来一点)再开始补料，还是溶氧一上升就立刻补呢，如果立刻补，貌似乙酸浓度就不能维持在比较低的水平了。
希望有经验的虫子不吝赐教，谢谢！
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1楼2013-06-08 15:57:57
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志子

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxingc: 金币+5, 很好的应助呀 2013-06-08 16:26:49
carot: 金币+1, 想问的是实际的操作经验，不需要理论性的东西，不过还是感谢参与。 2013-06-08 16:40:58
amisking: MicEPI+1, 很好的应助。 2013-06-08 22:11:59
乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。

降低乙酸产生量的措施：
1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生：
比生长速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等方法来降低比生长速率。
2、透析培养：
在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。
3、控制葡萄糖的浓度：
葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上，以减少乙酸的产生。

微生物学课本上提示的常用的控制方法主要有：
恒pH法：大肠杆菌会代谢葡萄等产生乙酸，使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标，该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果，容易造成补料体系出错。
恒溶氧法：菌体代谢时会消耗氧，使溶氧下降，当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根据溶氧曲线补加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。
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2楼2013-06-08 16:13:26
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xuru560

金虫 (正式写手)

达人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
carot: 金币+10, ★★★很有帮助, 非常感谢帮忙！ 2013-06-13 10:54:04
这位仁兄，我们实验室主要就是做大肠杆菌高密度发酵的，对于你说的这种情况，我们这边一般是等到碳源消耗完，再等到有机酸消耗完就开始补料，也就是说在这个过程你会发现DO出现两次升高，进入补料阶段后，乙酸的积累量就少了，但同时要注意当你进入诱导阶段后乙酸含量还是会大量积累，此时我建议你通入富氧空气！
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坚持+加油
3楼2013-06-09 09:53:15
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jiangronglu

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
carot(zhang8826857代发): 金币+3, 鼓励一下。 2013-06-26 10:28:50
菌生长的障碍是：①重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢；②外源蛋白不能分泌到胞外，在菌体内合
成后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会导致细
胞中毒或死亡, 因此工程菌的比生长速率往往远小于宿主菌。
高表达的障碍是：①外源基因的不稳定，造成表达的下降；②高生长速率与高表达之间的矛盾；③乙酸的产生；④
蛋白的降解。
高密度培养的措施:
分批补料培养：以分批培养为基础，吸取了连续培养的优点，可消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可以
弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控制了菌体的生长过程。因此，要实现重组大肠杆菌的高密度培
养，最常用和最有效的方法就是分批流加补料培养法。现在常用的是反馈补料培养。有几种反馈控制
控制基质浓度流加:用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极检测发
酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖电极通过反馈系统与补糖单元相连。当葡萄糖浓度在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄
糖浓度由于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄糖浓度始终保持恒
定，可避免葡萄糖的抑制效应，达到很高的细胞浓度。
恒pH流加：大肠杆菌在LB培养基上生长，pH会上升。这是由于菌体分解LB培养基中的胰蛋白胨，造成氨积
累的原因。因此用葡萄糖代替酸液进行恒pH流加。实验通过pH反馈控制系统流加葡萄糖，使pH恒定，结果推迟
了比生长速率降低的时间，细胞密度是无流加的2倍。也可以以葡萄糖代替酸液，以氨水代替氢氧化钠碱液，同时
流加氨水和葡萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌不适宜。
恒溶氧流加:用复膜氧电极来控制补糖。当培养液的氧饱和百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速率补糖。加入
的糖被菌利用则需要更多的氧，从而降低溶氧浓度，引起读数下降。当读数下降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就
会随之减少，溶氧逐渐上升，从而达到供需平衡。Konstantinov等进一步发展了这种方法，用DO-state法间歇流加
葡萄糖，通过控制溶氧、搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓度，从而获得高密度和高表达。
控制比生长速率的葡萄糖流加:菌体的比生长速率与代谢产物的表达密切相关。比生长速率太大，超过某一值，易产
生乙酸，这一比生长速率值称为菌体的乙酸产生临界比生长速率。通过考察得出最优比生长速率，控制溶氧、转速、
补糖来控制比生长速率。
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努力就有收获，人人都能成功
4楼2013-06-09 10:28:11
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