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核酸提取求助:帮忙分析下失败原因在哪?
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我的提取程序是200ul总消化体积,1%SDS,200ug/ml,消化过夜..... 之后是标准酚氯仿抽提.... 1%琼脂糖凝胶检测 只有最前沿有很弱的拖带出现(疑似RNA) 酚抽提后加入氯仿异戊醇(24:1)后离心后 上清很浑浊 出现大量絮状沉淀(这些是什么 蛋白质么?) , 加入氯仿异戊醇(24:1)后 好象无法混匀 始终是分层状态,这样正常么,不是要摇成乳状,再离心么 我重新提了一次还是这个样子 [ Last edited by linkfuture on 2007-10-12 at 11:58 ] |
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谢谢楼上2位的热心回复, 你们的意见我会考虑的 现在要理清头绪,逐项排除..... 关键我现在也不知道用哪种提取程序比较合适(不过肯定是微量样品,不知道有哪些改进方法能用,一直在找关于微量样品的提取的文献,收获不大) 有个问题,第一步的碾磨是不是很重要的, 我用螨的若虫和幼虫以及卵(数量都是20)都能提出来DNA 就是换成成虫(也是20只)就不行了,而且成虫的个体要大多了 到底是什么成分导致的失败呢....是不是成虫的身体中有抑制PK的成分或者其他抑制成分存在. 你们有做小型昆虫的么,也有类似的情况出现吗 若虫要比成虫的DNA容易提取 [ Last edited by linkfuture on 2007-10-12 at 18:03 ] |
13楼2007-10-12 18:01:06
guohuayin
木虫 (著名写手)
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telomerase(金币+2,VIP+0):thanks!欢迎来多多交流！！！
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抽提核酸中我的做法是 首先加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（体积比25：24：1），轻轻上下颠倒几次，混匀2分钟左右，12000rpm，离心10分钟； 然后吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比24:1)和上面的步骤一样，抽提一次，取上清 这两步试验可以反复三次，主要是去除蛋白质和糖类等杂质。 最后加入1/10体积的3M的醋酸钠（.PH5.3），2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。 －20度放置30分钟，室温15000rpm,离心10分钟，沉淀用70％的乙醇洗涤去除盐分，稍微干燥后，加入适量的缓冲液溶解。－20度冰箱中保存。 [ Last edited by guohuayin on 2007-10-9 at 16:33 ] |
2楼2007-10-09 16:31:15
3楼2007-10-10 12:19:10
yangguoxing888
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4楼2007-10-10 12:31:18
