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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 诚心求助，关于芽孢杆菌感受态细胞的制备！！！！！
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zd0017

铁虫 (小有名气)

[求助] 诚心求助，关于芽孢杆菌感受态细胞的制备！！！！！

诚心求助，我要做一株萎缩芽孢杆菌的基因敲除，在电转之前需要做这株菌的感受态细胞，以前从来没有做过，是个实验菜鸟，诚心希望各位做过类似实验的给点建议或相关资料，最好说下具体步骤，和实验中需注意的细节，小妹感激不尽！！！！！
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1楼 2013-05-25 18:10:45
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志子

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: MicEPI+1, good！ 2013-05-28 20:35:05
芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化

1)  将菌种接种在LB平板上37 ℃培养过夜。
2)  用接种环接一环菌苔于5mL GM I 溶液，在30 ℃慢摇床（125 r/min）振荡培养过夜。
3)  次日取2 mL转接到18 mL GM I 中，37 ℃快摇床（250 r/min）培养3.5 h。
4)  再取10 mL上一步骤的培养液转接到90 mL GM II 中，37 ℃慢摇床培养90 min后5,000 g，10 min离心收集菌体。
5)  用10 mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞可以直接用来转化。
6)  感受态细胞的保存：加30%的灭菌甘油至终浓度为10%，混匀后分装到离心管中（0.5 mL/tube），随即放到-70 ℃保存。
7)  转化时取出离心管，放在45 ℃水浴中溶化，然后在0.5 mL菌液中加入适量DNA（～1 ug/ml）。
8)  于37 ℃振荡（200 r/min）保温30 min后涂布相应抗性平板，再在37 ℃培养过夜，次日检查和验证转化子。

普通化学感受态细胞制备用试剂
[1]  10×最低盐溶液：K2HPO4 70 g，KH2PO4 30 g，（NH4）2SO4 10 g，（Na3C6H5O7•2H2O）5 g，MgSO4•7H2O 1 g，在蒸馏水中依次溶解，加水至500 mL。
[2]  氨基酸溶液（根据不同菌株的基因缺陷型准备）：10 mg/mL，贮于棕色瓶内，113℃灭菌30 min，用黑纸包裹。
[3]  GM I溶液：1×最低盐溶液95.6 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.4 mL，10%酵母汁1 mL，10 mg/mL氨基酸溶液0.5 mL（50 μg/mL）。
[4]  GM I溶液：1×最低盐溶液96.98 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.08 mL，10%酵母汁0.04 mL，1 M MgCl2 0.25 mL（2.5 mM），1 M CaCl2 0.05 mL（0.5 mM），10 mg/mL氨基酸溶液0.1 mL（5 μg/mL）。
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2楼2013-05-26 02:02:46
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zd0017

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 志子 at 2013-05-26 02:02:46
芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化

1)  将菌种接种在LB平板上37 ℃培养过夜。
2)  用接种环接一环菌苔于5mL GM I 溶液，在30 ℃慢摇床（125 r/min）振荡培养过夜。
3)  次日取2 mL转接到18 mL GM I 中，37 ℃快摇 ...

谢谢你的回复，我想问下每次转接的培养时间是如何确定的，不用测OD值吗，我的是萎缩芽孢杆菌，也按这个培养时间吗，还有之前配过10*最低盐溶液，但是放了一段时间后出现了结晶，是正常现象吗？非常感谢你！！！
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3楼2013-05-26 17:45:37
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