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[求助]
诚心求助，关于芽孢杆菌感受态细胞的制备！！！！！
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| 诚心求助，我要做一株萎缩芽孢杆菌的基因敲除，在电转之前需要做这株菌的感受态细胞，以前从来没有做过，是个实验菜鸟，诚心希望各位做过类似实验的给点建议或相关资料，最好说下具体步骤，和实验中需注意的细节，小妹感激不尽！！！！！ |
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准备明年的基金了
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面上再次挂了，太难了，躺也躺不了，倦也卷不过，小学校之殇！
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志子
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laozuzunzhe: MicEPI+1, good！ 2013-05-28 20:35:05
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芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化 1) 将菌种接种在LB平板上37 ℃培养过夜。 2) 用接种环接一环菌苔于5mL GM I 溶液，在30 ℃慢摇床（125 r/min）振荡培养过夜。 3) 次日取2 mL转接到18 mL GM I 中，37 ℃快摇床（250 r/min）培养3.5 h。 4) 再取10 mL上一步骤的培养液转接到90 mL GM II 中，37 ℃慢摇床培养90 min后5,000 g，10 min离心收集菌体。 5) 用10 mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞可以直接用来转化。 6) 感受态细胞的保存：加30%的灭菌甘油至终浓度为10%，混匀后分装到离心管中（0.5 mL/tube），随即放到-70 ℃保存。 7) 转化时取出离心管，放在45 ℃水浴中溶化，然后在0.5 mL菌液中加入适量DNA（～1 ug/ml）。 8) 于37 ℃振荡（200 r/min）保温30 min后涂布相应抗性平板，再在37 ℃培养过夜，次日检查和验证转化子。 普通化学感受态细胞制备用试剂 [1] 10×最低盐溶液：K2HPO4 70 g，KH2PO4 30 g，（NH4）2SO4 10 g，（Na3C6H5O7•2H2O）5 g，MgSO4•7H2O 1 g，在蒸馏水中依次溶解，加水至500 mL。 [2] 氨基酸溶液（根据不同菌株的基因缺陷型准备）：10 mg/mL，贮于棕色瓶内，113℃灭菌30 min，用黑纸包裹。 [3] GM I溶液：1×最低盐溶液95.6 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.4 mL，10%酵母汁1 mL，10 mg/mL氨基酸溶液0.5 mL（50 μg/mL）。 [4] GM I溶液：1×最低盐溶液96.98 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.08 mL，10%酵母汁0.04 mL，1 M MgCl2 0.25 mL（2.5 mM），1 M CaCl2 0.05 mL（0.5 mM），10 mg/mL氨基酸溶液0.1 mL（5 μg/mL）。 |
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