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幻雪水晶

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[求助] 关于EDC/NHS 反应

请教做过EDC、NHS反应的同学，在羧基修饰的纳米微球上修饰蛋白，以10mg/ml 的EDC和10mg/ml NHS来活化羧基1 h，pH5.0，然后在pH7.2左右加入蛋白，37摄氏度恒温培养2h，但偶联效果一直不太好，请问各位，我的实验过程有什么问题，或者大家有什么好的建议，请帮忙提一下，不胜感激啊

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羧基活化EDC\|DCC,NHS	纳米粒子EDC蛋白偶联	EDC/NHS活化羧基	医学用书
EDC/NHS反应	EDC/NHS	酰胺键交联(EDC/NHS)

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1楼2013-05-17 15:53:15

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4楼: Originally posted by ethmit1 at 2013-05-18 00:45:18
对了，不用活化1个小时，混在一起同时进行即可。我做的EDC/Sulfo-NHS反应还比较成功

意思是直接将EDC/NHS还有蛋白一起溶解在PBS中然后室温反应12h吗？刚开始做这个实验，很多地方不懂，还请多多指教啊

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5楼2013-05-18 17:52:56

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2楼: Originally posted by aircraftvip at 2013-05-17 22:48:33
1. EDC反应的最佳条件是pH 4.5 (或者在4-6范围之间），中性条件下效率大大降低。
2.反应时间2h太短了，延长到12h会好很多。
3. 室温足够了。
4.反应完应考虑用透析或柱子把小分子量的脲除掉。
good luck!

我是将EDC和NHS溶解在pH5左右的MES溶液中活化羧基，然后移去废液，再将溶解在PBS7.2左右中的蛋白加进去和羧基偶联的，蛋白的反应pH不是应该在偏碱条件下进行的吗，若将偶联反应也在pH5左右进行，偶联效果会不会不好？

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6楼2013-05-18 17:57:38

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7楼: Originally posted by ethmit1 at 2013-05-18 19:23:42
活化是在弱酸条件下比较好，酰胺键偶合在弱碱条件下进行，接近中性的环境可以同时兼顾两者。祝你好运啊

...

嗯，我先试试看，谢谢帮助啦，

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8楼2013-05-19 09:59:19

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9楼: Originally posted by luckydogzhang at 2013-05-20 09:41:19
EDC/Sulfo-NHS 效果会更好；不要把二者和蛋白放一起，蛋白本身有COOH，NH2，自身会反应掉的，可以试蛋白,buffer 的PH 4-5,而不是7；

感觉你活化的时间也挺长的，我记得文章上一般都是15-20 分钟的...

我看有的文章上也有活化40min的，因为实验结果总不好，就延长了活化时间，可以考虑下减少活化时间，延长偶联时间，但是蛋白的缓冲溶液怎么是4-5啊，应该是在中性条件下的啊

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10楼2013-05-20 11:42:56

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13楼: Originally posted by ethmit1 at 2013-05-30 01:03:11
楼主的问题解决了没啊，protein接上去没啊？...

还没有啊，

，再试试看吧，我是用MES作为溶剂配制EDC/NHS溶液的

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14楼2013-05-30 13:34:02

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17楼: Originally posted by 枫凌依稀 at 2013-10-18 11:07:18
活化羧基我看过只用EDC的，我想问问EDC和NHS活化羧基的机理是什么？是否可以只用EDC不加NHS

应该是可以的，我们实验室有只用EDC的，你可以试试，先活化1h，加入蛋白后反应3h然后过夜，就行了，我们实验室同学就是这么用EDC做的

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18楼2013-10-22 10:28:19

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22楼: Originally posted by 木叶super at 2014-02-27 16:47:10
我试了pH5.5的MES缓冲液中EDC/NHS活化羧基的，然后加入L-cys的，发现酰胺化的效率很低，L-cys、EDC/NHS都是5倍量羧基的，...

我后来是用水配置的100mg/mL EDC/25mg/mL NHS混合液，活化羧基1h，分离掉EDC/NHS然后加入足量蛋白反应3h并过夜，效果还是挺好的，你可以试试把蛋白量加大些

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23楼2014-03-01 19:10:37

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27楼: Originally posted by 木叶super at 2014-03-03 21:57:44
为什么我在pH5.0的MES中反应时pH变化和直接在水溶液中反应没有差别，你的MES溶液怎么配的呢，需不需要加氯化钠呢？我配的是先配成0.1M的MES溶液，然后用NaoH调pH5.0...

你要不试试别用MES了，你不是怕pH太大破坏氨基酸吗，5.0的MES估计会有影响吧。当时就直接配的MES，然后NaOH调pH就行了，后来没用MES

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28楼2014-03-04 09:47:54

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29楼: Originally posted by 女孩当自强 at 2014-03-20 09:10:02
我之前也是这么做的，都么有问题，但是最近同样条件做的一直团聚。。。。你们有这种情况发生吗？？快郁闷死了...

考虑一下是不是试剂坏了什么的，生物试剂容易坏就会引起团聚。我的EDC用的是100mg/mL的600uL，200uL 280umol/ml 的羧基磁球，超纯水定容至1ml，你可以试试

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32楼2014-03-20 10:08:56

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