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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 蛋白纯化
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stone0989

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化

近来纯化蛋白，深受打击。将目的基因转入载体pET-21b后，在宿主细胞BL21中进行原核表达。经过诱导后收集菌体，超声波破碎，目的蛋白在上清中有一定的表达量，但沉淀中也存在（我认为超声破碎不完全）。采用BBI家的Ni-NTA预装柱进行纯化，pH8.0 0-500mM的咪唑溶液进行梯度洗脱，杂蛋白与目的蛋白均在100mM时被洗脱下来，是为什么呢？？？求助！！！
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1楼 2013-05-16 09:05:59
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你们那可以做wb吗？建议鉴定一下，100洗下来的是不是降解带。若不可以的话，建议，上清加100mm咪唑，孵育一小时，知道怎么孵育吗？就是扣点散装镍柱，放到上清理，用搅拌子搅拌，或者放在50ml离心管中，在转盘上转，或者，放烧杯里，放要床上摇。一个小时可以了。
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4楼2013-05-17 12:17:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你确定是杂蛋白吗？一般his-tag的蛋白用100-200mM的咪唑应该可以洗下来的。如果是杂蛋白，一般会在咪唑浓度更低时洗脱下来。你可以在elute前多洗洗柱子。
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2楼2013-05-16 12:25:02
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qianshengguo

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这在我们做蛋白纯化中是很常见的，我们通常会采用离子柱、凝胶过滤或优化梯度来实现
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3楼2013-05-17 10:45:57
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

亲，你有洗杂吗？有杂带50mm咪唑都洗不下来的。或者用biorad公司的镍柱，特异性非常好，不挂杂带，有杂带就是降解带了。
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5楼2013-05-17 12:20:46
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