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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达
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yingrong147

铁虫 (初入文坛)

[交流] 原核表达 已有8人参与

我有一个大小1000bp左右的基因与pET-28a连接后导入到BL21中，按1：
50的比例接种至含卡那的50ml LB中，28℃，200rpm，2h，OD达到0.7，加入IPTG至终浓度分别为：0.1、0.5、1mM诱导，继续培养1、2、6、9h后取样进行SDS-PAGE。都没有表达，可能有哪些原因。会不会跟IPTG放太久有关？
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1楼 2013-04-23 14:25:21
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酶切专家

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-24 20:17:45
菌株必须是BL21(DE3)或其他带DE3的菌株，否则，因为无T7 RNA polymerase,pET系列的载体不能表达
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7楼2013-04-23 21:53:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-23 20:43:21
载体的序列是否正确？跑的全菌总蛋白还是可溶蛋白？你指目标蛋白分子量附近没有诱导出特异条带吗？IPTG一般不会出什么问题，都是配好母液冻存在-20°C。
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2楼2013-04-23 14:37:01
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yingrong147

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-23 14:37:01
载体的序列是否正确？跑的全菌总蛋白还是可溶蛋白？你指目标蛋白分子量附近没有诱导出特异条带吗？IPTG一般不会出什么问题，都是配好母液冻存在-20°C。

序列是正确的，全菌总蛋白，没有特异条带。
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3楼2013-04-23 15:35:02
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fuding6

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-23 20:43:31
要证明是不是IPTG的问题就得做个阳性对照，如果IPTG没问题，那就换载体换宿主试试。
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5楼2013-04-23 19:38:43
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