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yingrong147

铁虫 (初入文坛)

[交流] 原核表达 已有8人参与

我有一个大小1000bp左右的基因与pET-28a连接后导入到BL21中，按1：
50的比例接种至含卡那的50ml LB中，28℃，200rpm，2h，OD达到0.7，加入IPTG至终浓度分别为：0.1、0.5、1mM诱导，继续培养1、2、6、9h后取样进行SDS-PAGE。都没有表达，可能有哪些原因。会不会跟IPTG放太久有关？
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1楼 2013-04-23 14:25:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-23 20:43:21
载体的序列是否正确？跑的全菌总蛋白还是可溶蛋白？你指目标蛋白分子量附近没有诱导出特异条带吗？IPTG一般不会出什么问题，都是配好母液冻存在-20°C。
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2楼2013-04-23 14:37:01
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yingrong147

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-23 14:37:01
载体的序列是否正确？跑的全菌总蛋白还是可溶蛋白？你指目标蛋白分子量附近没有诱导出特异条带吗？IPTG一般不会出什么问题，都是配好母液冻存在-20°C。

序列是正确的，全菌总蛋白，没有特异条带。
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3楼2013-04-23 15:35:02
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yingrong147

铁虫 (初入文坛)
4楼2013-04-23 18:39:01
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fuding6

木虫 (小有名气)
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-04-23 20:43:31
要证明是不是IPTG的问题就得做个阳性对照，如果IPTG没问题，那就换载体换宿主试试。
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5楼2013-04-23 19:38:43
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yingrong147

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by fuding6 at 2013-04-23 19:38:43
要证明是不是IPTG的问题就得做个阳性对照，如果IPTG没问题，那就换载体换宿主试试。

IPTG有问题，那就是都不表达，还不是一样的吗？
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6楼2013-04-23 20:19:04
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酶切专家

金虫 (小有名气)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-24 20:17:45
菌株必须是BL21(DE3)或其他带DE3的菌株，否则，因为无T7 RNA polymerase,pET系列的载体不能表达
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7楼2013-04-23 21:53:57
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sunny-boy

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我想先问你下。
在你链接转化好后，有没有再把构建好的工程菌提质粒，然后PCR，跑个电泳，看看你的目的片段是不是已经成功链接？
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永远年轻，永远热泪盈眶~
8楼2013-04-23 23:10:47
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JT_Y1990

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-24 20:17:55
你可以让OD值达到0.5左右就诱导试试。我平常就是在这个值左右的，每次都表达了。大于0.9，诱导表达的可能性很小了！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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人生无限，只争朝夕！！！
9楼2013-04-23 23:49:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
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引用回帖:
3楼: Originally posted by yingrong147 at 2013-04-23 15:35:02
序列是正确的，全菌总蛋白，没有特异条带。...

重新配下IPTG，此外，同时用一个能诱导出来的菌株做阳性对照。
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10楼2013-04-24 03:29:04
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