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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 想添加个启动子，该这么弄啊？
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bolysu

禁虫 (著名写手)
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1楼 2013-04-15 10:38:08
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by fuding6 at 2013-04-16 16:05:25
楼主：pACYCDuet-1启动子是T7启动子，为什么不能在普通大肠杆菌中表达？pET系列都是T7启动子吧，他们就可以在普通的大肠杆菌里表达啊。

T7启动子只能被T7 RNA ploymerase识别，普通的大餐杆菌中没有lamada 噬菌体的整合，表达菌株BL21（DE3）中才有l，

pET系列的确都是T7启动子，但是不是在普通的大肠杆菌里表达的，只有转入BL21，或者rosseta等表达菌株中才能表达
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
12楼2013-04-29 14:27:29
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-04-15 16:28:58
原核基于sigma70的启动子分这么几个区域
activator结合位点（例如pBAD pLux，这个位点也可以放inhibitor，如pLtet  pLlac）
之后是-35区，pTac的是e coli的consensus序列 ttgaca（当然ttgact也可以 T7的pL就用的这个）
之后是-35到-10的spacer，这个区域可以放inhibitor，pTac在这里放了一个LacO1
-10区，pTac用得是consensus序列tataat（T7的pl是gatact）
-10之后到+10都可以放inhibitor，抑制效果不一（如pA1lacO1）  当然LacI和TetR的调控可以由一个远端的结合位点加强

在+1之后不要乱放东西，如果你不准备对你原有的Nterminal tag进行修正，那么只要包含原始的rbs序列就可以了
ATG往上数6个nt附近的agga类序列，总共留20个-30个nt就很保险了。
如果你要自己换得话。那么请使用rbs calculator计算或者用其他的5‘utr insulator进行设计

不过我看你要做敲初，那么是想看基因功能了？那样我建议你从头设计自己的质粒，完全没必要用那些改
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2楼2013-04-15 11:02:18
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回头太难

银虫 (知名作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-04-15 11:02:18
原核基于sigma70的启动子分这么几个区域
activator结合位点（例如pBAD pLux，这个位点也可以放inhibitor，如pLtet  pLlac）
之后是-35区，pTac的是e coli的consensus序列 ttgaca（当然ttgact也可以 T7的pL就用的这 ...

高手~仰慕
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3楼2013-04-15 20:00:56
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★ ★
bolysu(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-29 14:23:52
从原贴你写的东西看，你应该先去看看关于e coli基因表达各部分构成的内容。往多克隆位点里放一个单独的启动子一点意义都没有。另外T7启动子和e coli的非常不同，保险起见，我宁可重新构建个质粒，大概连可能出的小问题算在内也就两周工作量。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2013-04-16 00:26:06
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