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LiJie861027

新虫 (初入文坛)

[求助] 热启的意义何在?

热启的意义何在?热启应注意些啥?如镁离子热启,其目的是啥?
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
LiJie861027: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-04-23 16:56:30
引用回帖:
3楼: Originally posted by LiJie861027 at 2013-04-19 22:34:23
我需要构建载体,根据已克隆的目的基因的cDNA序列设计引物,以组织cDNA为模板克隆我的目的片段的ORF,在此过程中用到了热启(实验室以前的经验),用的酶是通用DNA聚合酶(Taq酶),热启就是为了抑制酶的活性吗?...

热起是为了避免酶在非PCR条件下发生作用,主要是避免样品混合时的非特异性扩增。克隆不用hot start的酶也是可以的,只是酶的效率和扩增专一性有所下降。
6楼2013-04-20 03:40:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流! 2013-04-14 21:01:31
你指是是什么?DNA聚合酶吗?如果问的是DNA聚合酶的hot start,因为普通的DNA聚合酶在室温下也有活性,混合反应体系时最好在冰上操作。hot start可以抑制酶的活性,使其更稳定,只有当开始PCR程序后酶才有活性。
2楼2013-04-14 10:58:52
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LiJie861027

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-14 10:58:52
你指是是什么?DNA聚合酶吗?如果问的是DNA聚合酶的hot start,因为普通的DNA聚合酶在室温下也有活性,混合反应体系时最好在冰上操作。hot start可以抑制酶的活性,使其更稳定,只有当开始PCR程序后酶才有活性。

我需要构建载体,根据已克隆的目的基因的cDNA序列设计引物,以组织cDNA为模板克隆我的目的片段的ORF,在此过程中用到了热启(实验室以前的经验),用的酶是通用DNA聚合酶(Taq酶),热启就是为了抑制酶的活性吗?
3楼2013-04-19 22:34:23
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

你是说PCR热启程序的意义何在是吗?
PCR起始时温度较低,引起引物与模板或者另一引物之间发生非特异性结合(错误配对)。这些非特异性结合在DNA聚合酶作用下会发生扩增反应,因而引起因为二聚体、错误扩增片段在内的产物,这些产物将严重影响以后的扩增。最简单的解释避免PCR反应体系的的液相放生浓缩。
4楼2013-04-19 23:27:28
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