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LiJie861027

新虫 (初入文坛)

[求助] 热启的意义何在?

热启的意义何在?热启应注意些啥?如镁离子热启,其目的是啥?
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

你是说PCR热启程序的意义何在是吗?
PCR起始时温度较低,引起引物与模板或者另一引物之间发生非特异性结合(错误配对)。这些非特异性结合在DNA聚合酶作用下会发生扩增反应,因而引起因为二聚体、错误扩增片段在内的产物,这些产物将严重影响以后的扩增。最简单的解释避免PCR反应体系的的液相放生浓缩。
4楼2013-04-19 23:27:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流! 2013-04-14 21:01:31
你指是是什么?DNA聚合酶吗?如果问的是DNA聚合酶的hot start,因为普通的DNA聚合酶在室温下也有活性,混合反应体系时最好在冰上操作。hot start可以抑制酶的活性,使其更稳定,只有当开始PCR程序后酶才有活性。
2楼2013-04-14 10:58:52
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LiJie861027

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-14 10:58:52
你指是是什么?DNA聚合酶吗?如果问的是DNA聚合酶的hot start,因为普通的DNA聚合酶在室温下也有活性,混合反应体系时最好在冰上操作。hot start可以抑制酶的活性,使其更稳定,只有当开始PCR程序后酶才有活性。

我需要构建载体,根据已克隆的目的基因的cDNA序列设计引物,以组织cDNA为模板克隆我的目的片段的ORF,在此过程中用到了热启(实验室以前的经验),用的酶是通用DNA聚合酶(Taq酶),热启就是为了抑制酶的活性吗?
3楼2013-04-19 22:34:23
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
LiJie861027: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢你的帮助 2013-04-23 16:55:36
镁离子浓度对于PCR扩增的专一性至关重要,如果PCR专一性扩增不够可以将镁离子浓度一般从低往高调,从1mmol/L-10mmol/L,但是不要再高了。有时还可加点很低浓度的BSA,也可以提高PCR的专一性扩增。
5楼2013-04-19 23:31:23
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