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LiJie861027

新虫 (初入文坛)

[求助] 热启的意义何在？

热启的意义何在？热启应注意些啥？如镁离子热启，其目的是啥？
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1楼 2013-04-14 10:47:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！ 2013-04-14 21:01:31
你指是是什么？DNA聚合酶吗？如果问的是DNA聚合酶的hot start，因为普通的DNA聚合酶在室温下也有活性，混合反应体系时最好在冰上操作。hot start可以抑制酶的活性，使其更稳定，只有当开始PCR程序后酶才有活性。
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2楼2013-04-14 10:58:52
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LiJie861027

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-14 10:58:52
你指是是什么？DNA聚合酶吗？如果问的是DNA聚合酶的hot start，因为普通的DNA聚合酶在室温下也有活性，混合反应体系时最好在冰上操作。hot start可以抑制酶的活性，使其更稳定，只有当开始PCR程序后酶才有活性。

我需要构建载体，根据已克隆的目的基因的cDNA序列设计引物，以组织cDNA为模板克隆我的目的片段的ORF，在此过程中用到了热启（实验室以前的经验），用的酶是通用DNA聚合酶（Taq酶），热启就是为了抑制酶的活性吗？
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3楼2013-04-19 22:34:23
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

你是说PCR热启程序的意义何在是吗？
PCR起始时温度较低，引起引物与模板或者另一引物之间发生非特异性结合（错误配对）。这些非特异性结合在DNA聚合酶作用下会发生扩增反应，因而引起因为二聚体、错误扩增片段在内的产物，这些产物将严重影响以后的扩增。最简单的解释避免PCR反应体系的的液相放生浓缩。
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4楼2013-04-19 23:27:28
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
LiJie861027: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢你的帮助 2013-04-23 16:55:36
镁离子浓度对于PCR扩增的专一性至关重要，如果PCR专一性扩增不够可以将镁离子浓度一般从低往高调，从1mmol/L-10mmol/L,但是不要再高了。有时还可加点很低浓度的BSA，也可以提高PCR的专一性扩增。
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5楼2013-04-19 23:31:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
LiJie861027: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-04-23 16:56:30
引用回帖:
3楼: Originally posted by LiJie861027 at 2013-04-19 22:34:23
我需要构建载体，根据已克隆的目的基因的cDNA序列设计引物，以组织cDNA为模板克隆我的目的片段的ORF，在此过程中用到了热启（实验室以前的经验），用的酶是通用DNA聚合酶（Taq酶），热启就是为了抑制酶的活性吗？...

热起是为了避免酶在非PCR条件下发生作用，主要是避免样品混合时的非特异性扩增。克隆不用hot start的酶也是可以的，只是酶的效率和扩增专一性有所下降。
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6楼2013-04-20 03:40:19
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