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zhoujlhn铜虫 (初入文坛)
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猪粪中细菌总DNA的提取
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小弟最近在提取猪粪中细菌的总DNA，老板说要自己摸索方法，没有考虑过用试剂盒，但是怎么提都没有提出来，请教各位前辈，有谁做过这一块的，请你给小弟我支支招！先谢谢了！ 下面是我用的方法：样品的前处理： 称取0.3g粪样放入2ml离心管中，加入1.5mlPBS（ph8.0）溶液，旋涡振荡混匀，4℃，800rpm离心10min;吸上清液转入另一干净2ml离心管中，4℃， 1000rpm离心 10min;再将上清液转入另一干净 2ml离心管中，重复此步骤，直至离心后上清液有菌体浑浊感为止；最后将上清液4℃，13000rpm离心5分钟，弃上清，收集沉淀。将沉淀用适量丙酮洗涤，并转入到 1.5ml离心管中，旋涡振荡混匀， 4℃，13000rpm离心5分钟，弃上清。用丙酮洗涤两次后，收集沉淀自然干燥或吹干 细胞裂解及DNA抽提： 1、 经过前处理后的样品，加600μL TE，20μL溶菌酶 (100mg/ml)，轻轻颠倒混匀，于37℃放置 30min; 2、 加入15μL蛋白酶K，500μL裂解液，55℃温浴3-4h，每 20min轻轻颠倒混匀一次; 3、 然后加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，轻轻混成乳浊液， 4℃，13000rpm离心10min，小心吸上相至空管中; 4、 再加等体积的氯仿/异戊醇(24:l)轻轻颠倒混匀，13000rpm离心 10min，小心吸上相至空管中;加等体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜; 5、 将DNA样品取出，13000rpm离心20min，倒去异丙醇，用80%异丙醇洗涤一次，13000rpm离心 10min，弃上清，并将异丙醇吹干; 6、 将DNA溶于60μL TE，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，于-70℃保存. |
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zhoujlhn
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