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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR结果很诡异 百思不得其解 求师兄师姐相助
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gissingtan

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by q317476148 at 2013-04-03 18:13:02
你用多少微升体系？以前我用50的老做不出来，要么各种杂带。换成25的就好做多了。

用的也是25 以前用50 也是p不出来
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11楼2013-04-05 12:25:56
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gissingtan

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-04 02:56:53
PCR没做出来。对提取的DNA模板是否消化了RNA，用了多少模板？

用了1μl ，这次提的DNA浓度很低，第一天下午提好的，第二天早上检测的，做了一天pcr总是出问题，晚上再次电泳检测DNA时发现DNA都降解了，以前都没出现过这样的问题，请问是怎么回事
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12楼2013-04-05 12:29:46
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gissingtan

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by chenguestc at 2013-04-04 07:56:31
扩增弥散，说明，模板太多或者退火温度太低，或者引物不特异，请根据情况，减少模板用量，提高退火温度试试，如果不行就换引物，每次试验尽量加上阴阳对照否则不好分析。。。。。。

恩，设计的引物特异性不太高。这次提的DNA浓度很低，第一天下午提好的，第二天早上检测的，做了一天pcr总是出问题，晚上再次电泳检测DNA时发现DNA都降解了，以前都没出现过这样的问题，请问是怎么回事
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13楼2013-04-05 12:31:07
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gissingtan

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by auroraA at 2013-04-04 15:28:59
除非你的primer有问题,或者DNA template 不好,否则看样子就一条路,你就涨annealing temperature吧,而且还要涨不少. template不要加多了,越多约不好.PCR很灵敏,条件合适的话,枪尖上沾点,都不用有准确体积就够了

谢谢~
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14楼2013-04-05 12:31:33
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gissingtan

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by yangcongcong at 2013-04-05 09:06:07
1.DNA质量不行   2.反应体系很不合理 3循环数减少10次
人工提DNA很可能是1，要是试剂盒那就2了，可能性很多，一步步联系吧，很正常

怎么才能提高DNA质量呢？
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15楼2013-04-05 12:32:07
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守好我的道

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 21:23:36
实验好像是：先提取基因组DNA，再以此为模板，进行PCR的操作。
个人建议：一步一步的确认实验。
首先,基因组DNA的提取，个人建议你做一个浓度低一点的琼脂糖胶，争取能让基因组能够跑出孔，以便与确认基因组的提取效果。个人感觉，你的提取结果不算好，有杂带。同时，PCR的结果不特异，也应该反思第一步的实验。个人建议，用好的基因组提取试剂盒再试一试。
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16楼2013-04-05 15:00:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by gissingtan at 2013-04-05 12:29:46
用了1μl ，这次提的DNA浓度很低，第一天下午提好的，第二天早上检测的，做了一天pcr总是出问题，晚上再次电泳检测DNA时发现DNA都降解了，以前都没出现过这样的问题，请问是怎么回事...

DNA一般比较稳定，提出的DNA降解的可能性不是很高，除非你加DNase消化。你确定提的DNA没有问题吗？提取的DNA浓度大约多少？
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17楼2013-04-05 23:40:04
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tcgpinder

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gissingtan: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-04-06 19:59:27
gissingtan: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-04-07 17:34:30
1、你提取的基因组DNA质量不是很好，我们用CTAB法或SDS法提取（可加入RNase A进行消化RNA）的DNA质量都很好！（OD260/OD280在1.7-1.9之间，OD260/OD230大于2）另外提取基因组DNA的电泳胶图条带要清晰单一，没有降解，就像你跑Lamda DNA一样；另外，我觉得你提取的DNA样品中，含有大量的蛋白、多糖等杂质，没有用酚氯仿异戊醇萃取干净；
2、做PCR时，反应体系中，DNA的浓度最好在50-150ng/ul时，加0.5-1.5ul； 另外，看看你设计引物的退火温度在多少（可以做一个梯度PCR找到合适的退火温度），预期目的片段大小是多少，以期设定退火温度和延伸时间；
3、看看你的胶孔有没有漏，还有就是琼脂糖胶均一不均一；
4、电泳的场压在3.5-8V/cm之间；
最后，希望你能找到原因，试验顺利！
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18楼2013-04-06 01:08:55
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gissingtan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-05 23:40:04
DNA一般比较稳定，提出的DNA降解的可能性不是很高，除非你加DNase消化。你确定提的DNA没有问题吗？提取的DNA浓度大约多少？...

图上的DNA是第一天下午提出来的，胶是第二天早上跑的，白天做了一天PCR都没有结果，所以晚上再次检测了一下DNA,发现都没有DNA了。图中marker 的条带应该是30nk。
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19楼2013-04-06 19:53:27
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gissingtan

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18楼: Originally posted by tcgpinder at 2013-04-06 01:08:55
1、你提取的基因组DNA质量不是很好，我们用CTAB法或SDS法提取（可加入RNase A进行消化RNA）的DNA质量都很好！（OD260/OD280在1.7-1.9之间，OD260/OD230大于2）另外提取基因组DNA的电泳胶图条带要清晰单一，没有降解 ...

每次提的DNA结果都很不稳定，有时碎片很多，有时量很少。最郁闷的是它不到一天就降解了，找不到原因。
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20楼2013-04-06 20:01:11
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