| 查看: 1654 | 回复: 9 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[求助]
求解救，被蛋白质困扰。。
|
|||
|
我做的蛋白质是假单胞菌分泌的胞外酶，提取方法直接离心降解培养基手机上清液，弃掉菌体沉淀。降解培养基的主要成分是葡萄糖，牛肉膏（微量），硝酸铵，磷酸盐缓冲液~现在正在做SDS-PAGE，已经做了接近一个月，还是有各种问题，已经没有信心做出来了，求指教，求解救~问题主要有以下几点： 1.胞外蛋白含量特别少，一般只有20ug/mL左右，有时候还检测不出来，所以蛋白质的条带特别不清楚。不知道有没有比较有效的浓缩方法？ 现在使用过超滤管，但是选择孔径大小上，我选择了最小的，3KD，离心一个小时浓缩效果不明显。不知道超滤管的会不会损失蛋白 还尝试过TCA沉淀方法，但是跑电泳之前加入loading煮沸5min之后沉淀不溶解，离心手机上清液上样，条带不好看，而且也不清楚，不知道用到的药品，三氯乙酸，脱氧胆酸钠，DTT，丙酮会不会影响电泳效果 2 接下来还要做二维电泳，做二维电泳的老师说，上清液中含糖对电泳影响特别大，建议我除糖，而且要过柱子，不知道要选择什么填料的柱子，是用什么缓冲液洗脱，需要多大的培养液，这种方法可行性高吗？这方面一点也不了解，还求大神指教。不知道过柱子之后蛋白纯度会不会提高？ 现在都快愁白头了，我们组之前没有师兄师姐做过，所以特别苦闷。。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 |
» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有85人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
7楼2013-04-03 10:57:47
gaojuan1985
新虫 (正式写手)
- 应助: 57 (初中生)
- 金币: 75.5
- 散金: 839
- 红花: 8
- 帖子: 561
- 在线: 119.6小时
- 虫号: 1374933
- 注册: 2011-08-21
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流，节日愉快 2013-04-01 16:00:54
shasha沙: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-03 08:58:36
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流，节日愉快 2013-04-01 16:00:54
shasha沙: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-03 08:58:36
|
1. 浓缩，可选用超滤或TCA沉淀，TCA沉淀是做SDS-PAGE浓缩比较经典的方法了。20 ug/ml的话可以取1-2 ml进行TCA沉淀，然后上样。沉淀不溶解？你肉眼能看到管底有沉淀？说明太多了。我通常用的量都是肉眼使劲看才能看到一点点沉淀的。TCA不会影响SDS-PAGE，但是对二维电泳就不清楚啦。 2. 除糖？这倒是很有挑战性。小的糖肯定能通过透析或者超滤除去。但是很大的糖想除掉还真不容易。LZ可以测一下糖含量嘛，再做决定 |
2楼2013-04-01 12:50:33
3楼2013-04-01 15:00:10
4楼2013-04-01 15:02:52