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[求助]
求解救，被蛋白质困扰。。
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我做的蛋白质是假单胞菌分泌的胞外酶，提取方法直接离心降解培养基手机上清液，弃掉菌体沉淀。降解培养基的主要成分是葡萄糖，牛肉膏（微量），硝酸铵，磷酸盐缓冲液~现在正在做SDS-PAGE，已经做了接近一个月，还是有各种问题，已经没有信心做出来了，求指教，求解救~问题主要有以下几点： 1.胞外蛋白含量特别少，一般只有20ug/mL左右，有时候还检测不出来，所以蛋白质的条带特别不清楚。不知道有没有比较有效的浓缩方法？ 现在使用过超滤管，但是选择孔径大小上，我选择了最小的，3KD，离心一个小时浓缩效果不明显。不知道超滤管的会不会损失蛋白 还尝试过TCA沉淀方法，但是跑电泳之前加入loading煮沸5min之后沉淀不溶解，离心手机上清液上样，条带不好看，而且也不清楚，不知道用到的药品，三氯乙酸，脱氧胆酸钠，DTT，丙酮会不会影响电泳效果 2 接下来还要做二维电泳，做二维电泳的老师说，上清液中含糖对电泳影响特别大，建议我除糖，而且要过柱子，不知道要选择什么填料的柱子，是用什么缓冲液洗脱，需要多大的培养液，这种方法可行性高吗？这方面一点也不了解，还求大神指教。不知道过柱子之后蛋白纯度会不会提高？ 现在都快愁白头了，我们组之前没有师兄师姐做过，所以特别苦闷。。 |
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 分子生化实验经验积累 |
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1. 浓缩，可选用超滤或TCA沉淀，TCA沉淀是做SDS-PAGE浓缩比较经典的方法了。20 ug/ml的话可以取1-2 ml进行TCA沉淀，然后上样。沉淀不溶解？你肉眼能看到管底有沉淀？说明太多了。我通常用的量都是肉眼使劲看才能看到一点点沉淀的。TCA不会影响SDS-PAGE，但是对二维电泳就不清楚啦。 2. 除糖？这倒是很有挑战性。小的糖肯定能通过透析或者超滤除去。但是很大的糖想除掉还真不容易。LZ可以测一下糖含量嘛，再做决定 |
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