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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求解救，被蛋白质困扰。。
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shasha沙

铜虫 (小有名气)

[求助] 求解救，被蛋白质困扰。。

我做的蛋白质是假单胞菌分泌的胞外酶，提取方法直接离心降解培养基手机上清液，弃掉菌体沉淀。降解培养基的主要成分是葡萄糖，牛肉膏（微量），硝酸铵，磷酸盐缓冲液~现在正在做SDS-PAGE，已经做了接近一个月，还是有各种问题，已经没有信心做出来了，求指教，求解救~问题主要有以下几点：
1.胞外蛋白含量特别少，一般只有20ug/mL左右，有时候还检测不出来，所以蛋白质的条带特别不清楚。不知道有没有比较有效的浓缩方法？
现在使用过超滤管，但是选择孔径大小上，我选择了最小的，3KD，离心一个小时浓缩效果不明显。不知道超滤管的会不会损失蛋白
还尝试过TCA沉淀方法，但是跑电泳之前加入loading煮沸5min之后沉淀不溶解，离心手机上清液上样，条带不好看，而且也不清楚，不知道用到的药品，三氯乙酸，脱氧胆酸钠，DTT，丙酮会不会影响电泳效果
2 接下来还要做二维电泳，做二维电泳的老师说，上清液中含糖对电泳影响特别大，建议我除糖，而且要过柱子，不知道要选择什么填料的柱子，是用什么缓冲液洗脱，需要多大的培养液，这种方法可行性高吗？这方面一点也不了解，还求大神指教。不知道过柱子之后蛋白纯度会不会提高？
现在都快愁白头了，我们组之前没有师兄师姐做过，所以特别苦闷。。
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1楼 2013-04-01 09:56:54
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流，节日愉快 2013-04-01 16:00:54
shasha沙: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-03 08:58:36
1. 浓缩，可选用超滤或TCA沉淀，TCA沉淀是做SDS-PAGE浓缩比较经典的方法了。20 ug/ml的话可以取1-2 ml进行TCA沉淀，然后上样。沉淀不溶解？你肉眼能看到管底有沉淀？说明太多了。我通常用的量都是肉眼使劲看才能看到一点点沉淀的。TCA不会影响SDS-PAGE，但是对二维电泳就不清楚啦。
2. 除糖？这倒是很有挑战性。小的糖肯定能通过透析或者超滤除去。但是很大的糖想除掉还真不容易。LZ可以测一下糖含量嘛，再做决定
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2楼2013-04-01 12:50:33
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shasha沙

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-04-01 12:50:33
1. 浓缩，可选用超滤或TCA沉淀，TCA沉淀是做SDS-PAGE浓缩比较经典的方法了。20 ug/ml的话可以取1-2 ml进行TCA沉淀，然后上样。沉淀不溶解？你肉眼能看到管底有沉淀？说明太多了。我通常用的量都是肉眼使劲看才能看到 ...

谢谢啦~TCA沉淀后能看到明显的白色沉淀，但是假如loading buffer之后不溶解，取上清液做电泳，条带还不如不浓缩的清楚，拖尾。我培养基里都是葡萄糖应该能用超滤除掉吧？对葡萄糖的量检测使用什么方法？
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3楼2013-04-01 15:00:10
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shasha沙

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-04-01 12:50:33
1. 浓缩，可选用超滤或TCA沉淀，TCA沉淀是做SDS-PAGE浓缩比较经典的方法了。20 ug/ml的话可以取1-2 ml进行TCA沉淀，然后上样。沉淀不溶解？你肉眼能看到管底有沉淀？说明太多了。我通常用的量都是肉眼使劲看才能看到 ...

我使用TCA沉淀后有明显的白色沉淀，煮沸之后也不会溶解，能把你TCA沉淀的方法发一下吗？是不是我的方法有问题~
我培养基里有葡萄糖，一般测葡萄糖的含量都用什么方法呢？
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4楼2013-04-01 15:02:52
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-04-05 13:51:47
煮沸之后不溶解，是因为votex的不够，我通常都是一个样品先votex几分钟，然后再煮，煮完之后再votex，百试百灵。振到手都抖了，就可以了
葡萄糖，可以用葡萄糖氧化酶的试剂盒去测，简单的你知道那个血糖试纸吧，糖尿病人用的那种，也可以测，不过我不记得浓度范围是多大了。总糖含量可以用酚硫酸法测定。
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5楼2013-04-01 15:12:20
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ourlab

捐助贵宾 (正式写手)

生命科学博士
★
gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-04-05 13:51:59
可考虑使用高饱和度（50%或60%）的氯化铵将酶沉淀下来，然后重新用少量缓冲液溶解。透析除去盐分，再进行下一步工作。这种方法适合大量的样品，费用低廉，酶活性保存得好。
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6楼2013-04-03 10:43:01
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shasha沙

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ourlab at 2013-04-03 10:43:01
可考虑使用高饱和度（50%或60%）的氯化铵将酶沉淀下来，然后重新用少量缓冲液溶解。透析除去盐分，再进行下一步工作。这种方法适合大量的样品，费用低廉，酶活性保存得好。

我试过这个方法，可能由于酶含量太小的原因，过夜之后没有沉淀~
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7楼2013-04-03 10:57:47
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小爪冰凉

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shasha沙 at 2013-04-01 15:02:52
我使用TCA沉淀后有明显的白色沉淀，煮沸之后也不会溶解，能把你TCA沉淀的方法发一下吗？是不是我的方法有问题~
我培养基里有葡萄糖，一般测葡萄糖的含量都用什么方法呢？...

请教一下做蛋白沉淀的三氯乙酸的纯度要求是多少？化学纯？分析纯？谢了！
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8楼2013-04-22 23:17:55
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shasha沙

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小爪冰凉 at 2013-04-22 23:17:55
请教一下做蛋白沉淀的三氯乙酸的纯度要求是多少？化学纯？分析纯？谢了！...

最好是分析纯，因为蛋白质纯化最好不要引入杂质
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9楼2013-04-26 11:01:10
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李玉洁

新虫 (初入文坛)
我也在做培养基里面的蛋白，用TCA沉淀，沉淀前加入蛋白酶抑制剂，但是培养基量太大，蛋白酶抑制剂需要的太多了，所以提出来的蛋白都降解了，看文献里面有的人用脱氧胆酸钠，再TCA沉淀，想问一下脱氧胆酸钠可以起到蛋白酶抑制剂的作用吗？可以保护蛋白不被降解吗
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10楼2019-03-26 17:23:51
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