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DDT+啄木鸟

[交流] 菌落PCR

我用蓝白斑筛选，挑取白色菌落做菌落PCR（用的是载体上的通用引物），一直P不出来，连接转化也没多大问题，请教高手分析一下问题所在。谢谢！
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1楼 2007-09-07 18:58:25
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU
做过几次菌落PCR，感觉可信度并不是很强，不过是挺方便的，要注意挑斑的时候要准，P出来的片段后的验证比较重要，最好还是酶切一下。有时会有假阳性出现。
P不出的可能原因有很多的，比如菌的问题，杂质太多破坏了PCR的体系，引物的特异性也很重要，等等......
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活着就要让人感受到你的存在。
5楼2007-09-09 20:44:10
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BigJake

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
DDT+啄木鸟(金币+2,VIP+0):谢谢你的帮助,两个金币请笑纳!
我觉得先做个实验确认一下你的载体上的引物吧：挑取白斑的时候同时挑取一个蓝斑，最好先在液体培养基中培养大约8h后，取1ul的培养液进行PCR，如果蓝斑 PCR也没有条带的话就应该是引物的问题啦；
如果蓝斑有条带，而白斑没有，那我想，可能那些白斑就是假阳性了。不知道楼主的白斑多不多，如果很多的话，那较大的可能就是污染的菌，别的菌，可能根本就不是宿主菌。这种情况建议重新做感受态。

另外，如果楼主有目的条带的引物的话，可以直接用插入片段的条带扩增试试看，同样以蓝斑做对照。

祝好运！
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2楼2007-09-08 08:51:01
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wu2008yao

木虫 (小有名气)
★
DDT+啄木鸟(金币+1,VIP+0):xiexie
我觉得是你的连接有问题
目的片段没有连到载体上去
这样导致假阳性特别多，另外最好说下具体的过程！
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生命是一团欲望，欲望不满足便痛苦，满足便无聊。人生就在痛苦和无聊之间摇摆！
3楼2007-09-08 09:26:22
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yzh-1999

至尊木虫 (著名写手)
其实的办法bigJake的办法是最好的办法！
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强则极辱，情深不寿
4楼2007-09-08 10:45:18
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