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DDT+啄木鸟

[交流] 菌落PCR

我用蓝白斑筛选,挑取白色菌落做菌落PCR(用的是载体上的通用引物),一直P不出来,连接转化也没多大问题,请教高手分析一下问题所在。谢谢!

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wu2008yao

木虫 (小有名气)


DDT+啄木鸟(金币+1,VIP+0):xiexie
我觉得是你的连接有问题
目的片段没有连到载体上去
这样导致假阳性特别多,另外最好说下具体的过程!
生命是一团欲望,欲望不满足便痛苦,满足便无聊。人生就在痛苦和无聊之间摇摆!
3楼2007-09-08 09:26:22
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BigJake

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★
DDT+啄木鸟(金币+2,VIP+0):谢谢你的帮助,两个金币请笑纳!
我觉得先做个实验确认一下你的载体上的引物吧:挑取白斑的时候同时挑取一个蓝斑,最好先在液体培养基中培养大约8h后,取1ul的培养液进行PCR,如果蓝斑 PCR也没有条带的话就应该是引物的问题啦;
如果蓝斑有条带,而白斑没有,那我想,可能那些白斑就是假阳性了。不知道楼主的白斑多不多,如果很多的话,那较大的可能就是污染的菌,别的菌,可能根本就不是宿主菌。这种情况建议重新做感受态。

另外,如果楼主有目的条带的引物的话,可以直接用插入片段的条带扩增试试看,同样以蓝斑做对照。

祝好运!
2楼2007-09-08 08:51:01
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yzh-1999

至尊木虫 (著名写手)

其实的办法bigJake的办法是最好的办法!
强则极辱,情深不寿
4楼2007-09-08 10:45:18
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

做过几次菌落PCR,感觉可信度并不是很强,不过是挺方便的,要注意挑斑的时候要准,P出来的片段后的验证比较重要,最好还是酶切一下。有时会有假阳性出现。
P不出的可能原因有很多的,比如菌的问题,杂质太多破坏了PCR的体系,引物的特异性也很重要,等等......
活着就要让人感受到你的存在。
5楼2007-09-09 20:44:10
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