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超氧化物歧化酶活性的测定
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| 测定烟叶中过氧化物酶活性，有一个试剂需要配60mmol/L DTT－乙醇是怎么配的？然后，还有计算公式是怎样的？谢谢。。。 |
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juanjuan118
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【答案】应助回帖
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1、SOD测定：SOD活性的测定是根据照光时，体系中产生氧自由基使硝基四唑蓝还原成蓝色甲(在560nm处有一吸收峰), 而超氧化物歧化酶作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照一半(50％)时所需的酶量。 14.5mmol/L的dl-甲硫氨酸（分子量149.21）（现用现配）：称取甲硫氨酸216.4mg，加少量Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用Tris-HCl(pH7.0)定容到100ml，即可。 30mmol/L的EDTA（292.25）（现用现配）：称取EDTA药品876.75mg，加少量Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用Tris-HCl(pH7.0)定容到100ml，即可。 2.25mmol/L的NBT（硝基四唑蓝）（817.6）（现用现配）：称取NBT药品183.96mg，加少量Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用Tris-HCl(pH7.0)定容到100ml，即可。 60umol/L的核黄素(376.36)（现用现配）：先称取225.81mg的核黄素，加少量50mM Tris-HCl(pH7.4)溶解后，用50mM Tris-HCl(pH7.4)定容到10ml，配制成60mmol/L的母液，然后取100ul到100ml的Tris-HCl(pH7.4)中，即可配制成60umol/L的核黄素。 测酶活的反应介质：测定前在54ml的14.5mmol/L的dl-甲硫氨酸中分别加入EDTA、NBT和核黄素各2ml，此为反应混合液。 酶活测定：在盛有1.0ml反应液的试管中，加入适量的酶液（50ul）（以抑制达50%作用酶浓度为最佳）。混匀后放在透明的试管架上，于光照培养箱中准确照光10min后，迅速测定560nm处的光密度。以不加酶液照光液的为对照，计算反应被抑制的百分比。按下式计算超氧化物歧化酶的活性 △A×N 酶活力 ＝─────────────── AO×W×T×V×50％ 式中：酶活力单位为每min每ｇ鲜重酶活单位数； AO为对照试管溶液在560nm处的吸光度值; △A为对照试管溶液在560nm处的吸光值与加入酶液的反应液在560nm处的吸光值的差; N为酶液总体积；W为提取酶液的样品鲜重g；T为照光时间(10min)；V为加入酶液的体积(ml)； |
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