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晨书暮琴

新虫 (初入文坛)

[求助] DGGE切胶回收测序多个条带是同种菌或所有条带都是同种菌是怎么回事？

各位前辈，得出DGGE图谱后切胶回收测序，用过直接PCR测序，也用过克隆测序，发现多个条带的测序结果都是一种菌。我听说两三个条带是一种菌的现象，但是五六个条带都是同一种，甚至整个图谱分离的条带都是一种菌，实在有些夸张。着急啊~不知到底什么原因。

比如下图中，2、3、4号是同一种（距离比较近，尚且能理解），1、8、12是同一种，6、9、10、11、14是同一种，最后导致整个图里就四五种细菌。


使用的PCR引物是341F-GC/518R，DGGE变性梯度是40-65%，180V，4.5h，测序方法是克隆测序。
还另外做过一组，其他条件一样，测序是直接PCR测序，结果更壮烈，所以条带都是一种菌。

求教求教~

haoyang.JPG
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1楼 2013-03-09 10:26:08
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leichenliu

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖 2013-04-20 11:16:38
一般来说，不同位置的条带比对到同一最近邻居也是很正常的。话说楼主的这些条带与最近邻居的序列同源性都一样吗？建议楼主直接比对下这些条带的序列。
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2楼2013-03-10 09:29:16
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晨书暮琴

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by leichenliu at 2013-03-10 09:29:16
一般来说，不同位置的条带比对到同一最近邻居也是很正常的。话说楼主的这些条带与最近邻居的序列同源性都一样吗？建议楼主直接比对下这些条带的序列。

谢谢你的回复。
我有点不太明白你说的“与最近邻居的序列同源性”这个应该怎么看？
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3楼2013-03-11 09:55:46
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leichenliu

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 晨书暮琴 at 2013-03-11 09:55:46
谢谢你的回复。
我有点不太明白你说的“与最近邻居的序列同源性”这个应该怎么看？...

同源性就是序列相似性
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4楼2013-03-11 10:34:46
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maomao1426

木虫 (著名写手)
你切胶以后有没有再纯化？纯化到一条只有一个条带？不然会有杂菌的。
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5楼2013-03-11 15:15:13
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晨书暮琴

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by maomao1426 at 2013-03-11 15:15:13
你切胶以后有没有再纯化？纯化到一条只有一个条带？不然会有杂菌的。

谢谢你的回复。你是指重新DGGE纯化吗？

另外，我连接T载体测序，就算有杂菌污染，挑出很多个克隆子去测序，结果也不该一样呀。
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6楼2013-03-15 11:15:00
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在雨中

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
zhang8826857: 金币+2, 鼓励回帖 2013-04-20 11:16:46
撸主呆呀，要切胶测序也只能使用341 907这种长片段引物的DGGE呀
341与518只有180bp的扩增片段，包含信息太少，而且现在genebank已经不接受小于200bp的基因序列提交了。
当然，341与907的DGGE扩增操作很难，不像338 518那么一做就成。
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7楼2013-03-16 08:34:16
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crystallynn

新虫 (初入文坛)
解决问题了吗？我最近做的也是，相近的条带都是一种菌。。。烦躁死啦。。。
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8楼2013-04-19 21:46:23
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xiaobai白

银虫 (小有名气)
请问楼主这个问题解决了吗？最近实验也是这样的问题 求指教
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9楼2013-05-21 11:18:37
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