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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 实时荧光定量 处理不同时间取样 想获取目的基因在胁迫条件下的表达变化
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桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量 处理不同时间取样 想获取目的基因在胁迫条件下的表达变化

材料：4摄氏度处理条件下，分别在0,0.5,1,2,3,4,5等时间后取材，提取RNA，反转录cDNA，并以此为模板进行实时荧光定量。
目的：得知目的基因在冷胁迫条件下表达量的变化（相对定量）。

求助：
1、相对定量是否需要做标准曲线？标曲制作时，是不是内参一个反应，目的基因一个反应，不能同时做的么？
2、以上各个时间段时取材是否应该放在同一个反应板上、同时进行？
3、如果2是正确的话，那么扩增内参基因的样品选择哪个呢？理论上应该时一个处理时间段的样品的内参、目的基因一起反应，这样内参才具有参考的价值吧~

我糊涂了~请大神指导！谢谢~

[ Last edited by 桃之夭夭pFly on 2013-3-6 at 15:30 ]
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1楼 2013-03-06 15:26:23
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桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
期待您的回答~
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2楼2013-03-06 21:43:22
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phhcrab

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1.就你的研究目的来说，不是必须做标准曲线的。但是最好是稀释个梯度，做个标准曲线看看扩增效率如何，这个仪器软件可以计算出来的。不做的话么，就是默认扩增效率都是100%了。
2.如果能同时进行的话，最好是同时进行，方便做比较，也能保证所有样品是在完全一样的仪器运行环境下进行的。
3.每一个样品都要做内参。并且最好做一个预实验，看你选的内参是否合适。因为内参基因也是相对的，并非在所有的实验环境中都一定稳定。
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3楼2013-03-12 21:05:45
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