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桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量 处理不同时间取样 想获取目的基因在胁迫条件下的表达变化

材料:4摄氏度处理条件下,分别在0,0.5,1,2,3,4,5等时间后取材,提取RNA,反转录cDNA,并以此为模板进行实时荧光定量。
目的:得知目的基因在冷胁迫条件下表达量的变化(相对定量)。

求助:
1、相对定量是否需要做标准曲线?标曲制作时,是不是内参一个反应,目的基因一个反应,不能同时做的么?
2、以上各个时间段时取材是否应该放在同一个反应板上、同时进行?
3、如果2是正确的话,那么扩增内参基因的样品选择哪个呢?理论上应该时一个处理时间段的样品的内参、目的基因一起反应,这样内参才具有参考的价值吧~

我糊涂了~请大神指导!谢谢~

[ Last edited by 桃之夭夭pFly on 2013-3-6 at 15:30 ]
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phhcrab

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1.就你的研究目的来说,不是必须做标准曲线的。但是最好是稀释个梯度,做个标准曲线看看扩增效率如何,这个仪器软件可以计算出来的。不做的话么,就是默认扩增效率都是100%了。
2.如果能同时进行的话,最好是同时进行,方便做比较,也能保证所有样品是在完全一样的仪器运行环境下进行的。
3.每一个样品都要做内参。并且最好做一个预实验,看你选的内参是否合适。因为内参基因也是相对的,并非在所有的实验环境中都一定稳定。
3楼2013-03-12 21:05:45
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