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czc945

新虫 (初入文坛)

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虫号: 1460676
注册: 2011-10-25
专业: 食品科学基础

[求助] 荧光原位杂交实验求助

我想做细菌的计数，用荧光原位杂交的方法，可是在荧光显微镜下‘；用40X镜头只看到DAPI紫外下的蓝色，而看不到探针绿光激发出的颜色，是没杂交上吗？基本在绿光下没有东西，诚心求各位研友帮忙解答下。我的实验步骤如下。
1、菌液稀释（大肠杆菌，肠球菌，乳酸菌），4%多聚甲醛固定1h，10000rpm离心5min，去上清，1XPBS重悬。重复两次。

2、玻片铬明胶处理

3、10μ菌液涂匀

4、37℃烘干

5、10xPBS洗两次，一次5min。

6、梯度乙醇脱水

6.1、加10μ 1mg/mL溶菌酶

6.2、37℃孵育15min

6.3、梯度乙醇脱水

7、加10μ蛋白酶K（1mg/mL）

8、37℃孵育半小时

9、梯度乙醇脱水

10、加杂交液，加盖玻片，湿盒中46℃预杂交30min

11、梯度乙醇脱水

12、加探针杂交液（EUB388探针），加盖玻片，46℃杂交过夜

13、预热到48℃洗脱液洗脱20min。然后DAPI染色。

14、荧光显微镜镜检。

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