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飞儿豆豆

金虫 (小有名气)

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[交流] 羟脯氨酸的含量测定，急急急~

各位虫友有人用紫外测出过胶原蛋白里面的羟脯氨酸的含量么？比较稳定的么？
我试过几种方法，都失败了，请各位帮着想想是什么原因，有什么办法解决或者有更好的办法可以测出羟脯氨酸的？小虫不胜感激。
方法一
(l)7%氯胺T水溶液，暗室保存。
(2)醋酸一柠檬酸缓冲液(PH一6.0):579醋酸钠(CH3C00Na.3H2O)，37.59二水柠檬酸三钠，5.59一水柠檬酸，385mL异丙醇共同溶于水，定容至IL，室温保存。
(3)重结晶对二甲氨基苯甲醛溶于57%高氯酸，配成2:3(g:mL)溶液，棕色瓶保存三周有效。
(4)氧化剂A液:7%氯胺T:醋酸一柠檬酸缓冲液(V/V)=1:4，用前配制;显色剂B
液:对二甲氨基苯甲醛溶液:异丙醇(V/V)=3:13，用前配制。精确称取标品轻脯氨酸30mg定容于loomL，稀释10倍成为3omoL/L标准液。分别吸取omL，lmL，ZmL，3mL，4mL，5mL标准液定容至50mL，各自取定容后溶液lmL于试管中，向每只试管加入0.4mL异丙醇和0.2mLA液，搅拌3一5min，再分别向每只试管加入B液2.6mL，搅拌，60℃水浴25min，冷却，于558nm处比色。根据吸光值绘制标准曲线。

方法二
试剂的配制柠檬酸缓冲液:柠檬酸钠120g、冰醋酸12ml、柠檬酸46g、氢氧化
钠34g溶解于蒸馏水中，调整PH值至6.0，然后定容至1000mL。‘
0.05mol/L氯胺T溶液:称取氯胺T7.05g，溶解于100mL蒸馏水中，然后加入
乙二醉独甲醚150mL，再加入250mL柠檬酸缓冲液混合均匀。
对二甲基氨基苯甲醛试剂A:取无水乙醇20mL，慢慢加入浓硫酸2.74ml;试剂
B:取对二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入无水乙醇40mL，水浴加热使其完全溶解并冷却至室温，然后将A液慢慢加入B，混合均匀。
3.5mol/L高氯酸溶液:取27ml高氯酸，以蒸馏水定容到100mL。
羟脯氨酸标准储存液：准确称取L羟基脯氨酸标准品1OOmg，加入O.O1mol/L盐酸中溶解，稀释并定容到1OOmL.在冰箱中保存。羟脯氨酸标准工作液：吸取羟脯氨酸标准储存液1OmL到1OOmL容量瓶中，用蒸馏水定容到1OOmL(临用前配)，浓度为1OOug/mL.
吸取羟脯氨酸标准工作液I.O、2 0、2 5、3 0、3 5、40、4.5mL，分别用蒸馏水定容到1OOmL.以蒸馏水为空白，分别吸取上述标准液1mL.加入1mL柠檬酸缓冲液和1mL 0.05mol/L氯胺T溶液，室温(25℃)氧化1Omin后，加入高氯酸1mL(3.5mol/L)，放置1Omin，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂1mL，在65℃水浴显色1Omin．冷却后在561nm处测吸光度。以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程
方法三
①pH6.8的柠檬酸缓冲溶液：溶解26.0g柠檬酸C6H8O7•H2O，14.0g氢氧化钠和78.0g醋酸钠于500mL水中，转移溶液到1000mL容量瓶中。加入250mL正丙醇，用水稀释至刻度。此液于4℃在深色瓶中保存，可稳定几个星期；
②氯胺T试剂：溶解1.41g氯胺T于100mL如上的缓冲试剂中（现配现用）；
③对二甲氨基苯甲醛试剂：称取10.0g对二甲氨基苯甲醛，溶解于35.0mL高氯酸
[60%(m/m)]，缓慢加入65.0mL异丙醇（现配现用）；
④羟脯氨酸标准储备液，500μg•mL-1：准确称取羟脯氨酸标准品50.0mg，用少量水溶解于100mL容量瓶中，加入一滴3mol•L-1硫酸，定容至刻度。该溶液在4℃下能稳定至少1月；
⑤羟脯氨酸标准工作液：吸取5mL羟脯氨酸标准储备液于500mL容量瓶中，用蒸馏
水稀释定容，质量浓度为5μg•mL-1（现配现用）。
羟脯氨酸标准曲线的绘制
准确吸取羟脯氨酸标准工作液10.0、20.0、30.0、40.0与50.0mL，分别用蒸馏水定容至100mL，此标准溶液的羟脯氨酸浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5μg•mL-1
；吸取4mL上述稀释好的溶液于具塞试管中，加入2.00mL氯胺T，摇匀后在室温下放置20min，加入2.00mL显色剂，摇匀后迅速将试管移至60℃的水浴中，保温20min，再用流动的水冷却试管至少3min，室温下放置30min，最后用紫外可见分光光度计在558±2nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，建立线性回归方程。空白溶液用蒸馏水代替，过程同上。
方法一没有最后测的溶液是澄清的而且为黄色，测出的值也是不稳定忽高忽低。我用的是L-羟脯氨酸的标准品。
方法二试剂B 出现不溶现象，加入的无水乙醇和对二甲基氨基苯甲醛分层，像油水分离的状态，下层发绿，油状，并且我的试剂是新买的。加完高氯酸后10min-20min试管会出现白色絮状物，最后沉底，包括空白组。
方法三第一步加入正丙醇就会和盐溶液分层。正丙醇不溶盐，将盐析出。

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