应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Nhe I和Hind III 双酶切pcDNA3.1(+)和目的片段2300bp，却连不上，求各位帮忙啊
182/2返回列表上一页12
查看: 3862  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yiyijiayou21

新虫 (初入文坛)
小丹木木: 编辑内容 2013-03-13 16:34


[ Last edited by 小丹木木 on 2013-3-13 at 16:34 ]
11楼2013-03-12 16:41:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yiyijiayou21

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 小love肖 at 2013-03-12 13:48:26
你现在转化出来的应该是原来的没有酶切完全的质粒，也就是你插入片段上的4.7kb的载体，因为它没有酶切完全，或者是有一些环状但非超螺旋DNA，正好跑到你的插入片段2.3Kb的位置，因为只有很微弱的量，你在胶图上看不 ...

如果是由于含有目的片段的重组质粒（2.3kb+4.7kb)没有完全酶切开而造成的转化时将其转化如感受态，那么之后挑去的单菌落培养然后提质粒跑电泳也应该是比空载质粒（pcDNA3.1，5.5kb）要大，而且双酶切结果应该显示含有目的片段的，但是现在结果显示的却是和现在这个空载质粒（pcDNA3.1）的酶切结果一样的，所以说是不是应该可以排除这个原因呢。还是我对你的回复哪里理解错误？

你提供的解决方法是要把含有目的片段的重组质粒分别单酶切，是吧？那想问一下现在用的空载质粒（pcDNA3.1）可以直接双酶切？你之前说的这两种酶你经常用，酶切效果都很好，基本上酶切2ug的质粒，分别加1ul的酶1个小时就能切开了？你双酶切载体是pcDNA3.1（-）吗？你所用的内切酶是NEB的还是TaKaRa？
赞一下 回复此楼
学会克服贪念，提升自己！
12楼2013-03-12 16:54:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yiyijiayou21

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 小love肖 at 2013-03-12 13:48:26
你现在转化出来的应该是原来的没有酶切完全的质粒，也就是你插入片段上的4.7kb的载体，因为它没有酶切完全，或者是有一些环状但非超螺旋DNA，正好跑到你的插入片段2.3Kb的位置，因为只有很微弱的量，你在胶图上看不 ...

如果是由于含有目的片段的重组质粒（2.3kb+4.7kb)没有完全酶切开而造成的转化时将其转化如感受态，那么之后挑去的单菌落培养然后提质粒跑电泳也应该是比空载质粒（pcDNA3.1，5.5kb）要大，而且双酶切结果应该显示含有目的片段的，但是现在结果显示的却是和现在这个空载质粒（pcDNA3.1）的酶切结果一样的，所以说是不是应该可以排除这个原因呢。还是我对你的回复哪里理解错误？

你提供的解决方法是要把含有目的片段的重组质粒分别单酶切，是吧？那想问一下现在用的空载质粒（pcDNA3.1）可以直接双酶切？你之前说的这两种酶你经常用，酶切效果都很好，基本上酶切2ug的质粒，分别加1ul的酶1个小时就能切开了？你双酶切载体是pcDNA3.1（-）吗？你所用的内切酶是NEB的还是TaKaRa？
赞一下 回复此楼
学会克服贪念，提升自己！
13楼2013-03-12 16:55:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小love肖

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
yiyijiayou21: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-03-13 09:10:56
我使用的是NEB的酶，我没有酶切过pcDNA3.1，我切过pcDNA5，还有我们自己的5Kb的载体，我觉得pcDNA3.1最好也是先单酶切回收后再用另一种酶切，它们之间只有100bp，可能会酶切不完全，以上意见仅供参考
赞一下 回复此楼
14楼2013-03-13 08:30:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yiyijiayou21

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 小love肖 at 2013-03-13 08:30:52
我使用的是NEB的酶，我没有酶切过pcDNA3.1，我切过pcDNA5，还有我们自己的5Kb的载体，我觉得pcDNA3.1最好也是先单酶切回收后再用另一种酶切，它们之间只有100bp，可能会酶切不完全，以上意见仅供参考

好的，我试试看，多谢帮忙！
赞一下 回复此楼
学会克服贪念，提升自己！
15楼2013-03-13 09:11:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

TNTandPX

金虫 (小有名气)
我用Nde1跟xho1双切过，可以的。（NEB）
赞一下 回复此楼
Tosurviveistothrive.
16楼2013-04-23 22:29:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

易翔仪冲

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-03-03 20:03:21
酶切图谱http://tools.invitrogen.com/content/sfs/vectors/pcdna3.1-.pdf

从你的描述来看，可能是你的载体和外源片段酶切不完全（尤其是载体酶切不完全），导致大量的载体自连，所以都是空载体。
你用的这两个 ...

你好，请问NheI对CpG敏感，这对酶切质粒影响大吗？
赞一下 回复此楼
17楼2013-07-15 15:21:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

易翔仪冲

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小love肖 at 2013-03-12 11:17:56
是不是你的目的片段没有切开呢？你的目的片段是PCR片段还是从别的载体上酶切下来的呢？这两种酶我经常用，酶切效果都很好，基本上酶切2ug的质粒，分别加1ul的酶1个小时就能切开了，你应该从头重新做一遍，也许体系中 ...

你用NheI加1μ就够了？这个酶对CpG敏感不会有影响吗？
赞一下 回复此楼
18楼2013-07-15 15:26:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yiyijiayou21 的主题更新
182/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 7lpolszZVXgi 2026-08-14 8/400 2026-08-15 11:53 by KxMI1BYBxWX1
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 7lpolszZVXgi 2026-08-14 6/300 2026-08-15 09:28 by sunzitan
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 5/250 2026-08-15 07:09 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] filecode +7 cratir 2026-08-14 11/550 2026-08-15 06:19 by 学员8dgXkO
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 5/250 2026-08-15 04:45 by 4wMiSEwB6436
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 4/200 2026-08-15 01:28 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 5/250 2026-08-15 00:16 by 4wMiSEwB6436
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 5/250 2026-08-14 22:32 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +8 布布和一二 2026-08-10 11/550 2026-08-14 14:58 by Equinoxhua
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[硕博家园] 请教兼职经验 +3 是阿文鸭 2026-08-09 3/150 2026-08-14 12:07 by HER12025
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭