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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Nhe I和Hind III 双酶切pcDNA3.1(+)和目的片段2300bp，却连不上，求各位帮忙啊
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yiyijiayou21

新虫 (初入文坛)
小丹木木: 编辑内容 2013-03-13 16:34


[ Last edited by 小丹木木 on 2013-3-13 at 16:34 ]
11楼2013-03-12 16:41:43
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yiyijiayou21

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 小love肖 at 2013-03-12 13:48:26
你现在转化出来的应该是原来的没有酶切完全的质粒，也就是你插入片段上的4.7kb的载体，因为它没有酶切完全，或者是有一些环状但非超螺旋DNA，正好跑到你的插入片段2.3Kb的位置，因为只有很微弱的量，你在胶图上看不 ...

如果是由于含有目的片段的重组质粒（2.3kb+4.7kb)没有完全酶切开而造成的转化时将其转化如感受态，那么之后挑去的单菌落培养然后提质粒跑电泳也应该是比空载质粒（pcDNA3.1，5.5kb）要大，而且双酶切结果应该显示含有目的片段的，但是现在结果显示的却是和现在这个空载质粒（pcDNA3.1）的酶切结果一样的，所以说是不是应该可以排除这个原因呢。还是我对你的回复哪里理解错误？

你提供的解决方法是要把含有目的片段的重组质粒分别单酶切，是吧？那想问一下现在用的空载质粒（pcDNA3.1）可以直接双酶切？你之前说的这两种酶你经常用，酶切效果都很好，基本上酶切2ug的质粒，分别加1ul的酶1个小时就能切开了？你双酶切载体是pcDNA3.1（-）吗？你所用的内切酶是NEB的还是TaKaRa？
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12楼2013-03-12 16:54:39
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yiyijiayou21

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 小love肖 at 2013-03-12 13:48:26
你现在转化出来的应该是原来的没有酶切完全的质粒，也就是你插入片段上的4.7kb的载体，因为它没有酶切完全，或者是有一些环状但非超螺旋DNA，正好跑到你的插入片段2.3Kb的位置，因为只有很微弱的量，你在胶图上看不 ...

如果是由于含有目的片段的重组质粒（2.3kb+4.7kb)没有完全酶切开而造成的转化时将其转化如感受态，那么之后挑去的单菌落培养然后提质粒跑电泳也应该是比空载质粒（pcDNA3.1，5.5kb）要大，而且双酶切结果应该显示含有目的片段的，但是现在结果显示的却是和现在这个空载质粒（pcDNA3.1）的酶切结果一样的，所以说是不是应该可以排除这个原因呢。还是我对你的回复哪里理解错误？

你提供的解决方法是要把含有目的片段的重组质粒分别单酶切，是吧？那想问一下现在用的空载质粒（pcDNA3.1）可以直接双酶切？你之前说的这两种酶你经常用，酶切效果都很好，基本上酶切2ug的质粒，分别加1ul的酶1个小时就能切开了？你双酶切载体是pcDNA3.1（-）吗？你所用的内切酶是NEB的还是TaKaRa？
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13楼2013-03-12 16:55:22
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小love肖

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
yiyijiayou21: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-03-13 09:10:56
我使用的是NEB的酶，我没有酶切过pcDNA3.1，我切过pcDNA5，还有我们自己的5Kb的载体，我觉得pcDNA3.1最好也是先单酶切回收后再用另一种酶切，它们之间只有100bp，可能会酶切不完全，以上意见仅供参考
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14楼2013-03-13 08:30:52
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yiyijiayou21

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 小love肖 at 2013-03-13 08:30:52
我使用的是NEB的酶，我没有酶切过pcDNA3.1，我切过pcDNA5，还有我们自己的5Kb的载体，我觉得pcDNA3.1最好也是先单酶切回收后再用另一种酶切，它们之间只有100bp，可能会酶切不完全，以上意见仅供参考

好的，我试试看，多谢帮忙！
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15楼2013-03-13 09:11:46
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TNTandPX

金虫 (小有名气)
我用Nde1跟xho1双切过，可以的。（NEB）
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Tosurviveistothrive.
16楼2013-04-23 22:29:16
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易翔仪冲

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-03-03 20:03:21
酶切图谱http://tools.invitrogen.com/content/sfs/vectors/pcdna3.1-.pdf

从你的描述来看，可能是你的载体和外源片段酶切不完全（尤其是载体酶切不完全），导致大量的载体自连，所以都是空载体。
你用的这两个 ...

你好，请问NheI对CpG敏感，这对酶切质粒影响大吗？
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17楼2013-07-15 15:21:37
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易翔仪冲

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小love肖 at 2013-03-12 11:17:56
是不是你的目的片段没有切开呢？你的目的片段是PCR片段还是从别的载体上酶切下来的呢？这两种酶我经常用，酶切效果都很好，基本上酶切2ug的质粒，分别加1ul的酶1个小时就能切开了，你应该从头重新做一遍，也许体系中 ...

你用NheI加1μ就够了？这个酶对CpG敏感不会有影响吗？
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18楼2013-07-15 15:26:37
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