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x潇湘竹zh

新虫 (初入文坛)

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[求助] cDNA-AFLP 预扩非弥散

我在做cDNA-AFLP，出现如下问题，请教各位大侠：
在酶切连接后直接预扩，电泳图非弥散状态，而是有几条特异条带。见附件

RNA提取采用的艾德莱RNA提取试剂盒，并用TakaRa公司的双链合成试剂盒（D6130）合成 cDNA双链，用氯仿抽提纯化。而后进行酶切连接，体系如下：
T4 Buffer：2ul
EcoR I接头(5pmol/ul)：0.8ul
Mse I接头(50pmol/ul)：0.8ul
cDNA:4ul
T4连接酶:0.3ul
EcoR I:0.2ul
Mse I:0.4ul
加dd H2O至20ul
37℃过夜。后进行预扩。

自己的分析：
1、可能为酶切连接过程出现问题。但以DNA为对照进行实验，该体系应该不存在问题。
2、考虑为cDNA的问题。个人也觉得通过氯仿抽提后cDNA纯度可能存在问题，但一是没有更好的方法，二是觉得cDNA不纯会使酶切不充分，但不致影响这么大吧。
3、可能为合成的cDNA即出现问题。RNA提取质量不算好，勉强能用，cDNA电泳发现条带较小，但呈弥散状。另外请教，我在合成cDNA第二链时，使用PCR 16℃ 2小时一步打开了热盖；在最后一步说明书让加EDTA和SDS终止反应，我只加了SDS，是否会有影响？
请各位大侠指教，万分感谢。

预扩1.jpg

预扩2.jpg

预扩3.jpg

cDNA图.jpg

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