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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Xho I 和Not I双酶切后电泳出现严重拖尾
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liurz

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-25 08:34:07
感觉是酶切体系中质粒用量太大。你的质粒看起来浓度不错，20ul酶切体系里面你放了多少ug质粒？

本人初次做这个，没有DNA浓度测定仪器，根据MARKER大概估计的。
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11楼2013-01-25 14:28:49
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liurz

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yesali at 2013-01-25 08:55:25
质粒的量过多，适当减少质粒
另外酶切体系可适当增大到40ul

不是质粒，是线性基因，800bp左右，体系是50ul
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12楼2013-01-25 14:29:35
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liurz

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by l_dot at 2013-01-25 12:48:16
酶切体系为20ul， 质粒不要超过1微克
先测下质粒浓度再加

没有DNA浓度测定仪，实验室师兄师姐都是根据marder估计的
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13楼2013-01-25 14:30:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by liurz at 2013-01-25 14:28:49
本人初次做这个，没有DNA浓度测定仪器，根据MARKER大概估计的。...

那么根据marker也可以估计出来大致浓度。总之20ul体系里面的DNA最好不要超过1ug，绝对不要超过2ug，否则酶切很难完全。
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14楼2013-01-25 14:36:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
liurz: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-01-26 23:01:25
引用回帖:
7楼: Originally posted by liurz at 2013-01-25 13:34:35
抱歉，补充一下，酶切体是50ul，昨天写错了。
酶切体系50ul，Xho I 和Not I各1ul（可以酶切2ug DNA），NEBbuffer 3加了5ul，纯化后目的基因30ul（三PCR管一起纯化得到），100×BSA 0.5ul，剩余无菌水补足50ul。37℃ ...

从胶上定量也需要你的带与marker相应的带亮度差不多啊，你的这个用眼睛直接估计有些难度。按照你的估计700ng是上了多少ul？
虽然不知道你的PCR扩增效率和回收效率，总之不一定要都切了吧。酶切后的一般是做连接，所需的DNA量是很少的，一般是低于100ng的。我认为你切1ug是足够的了。
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15楼2013-01-25 14:46:45
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liurz

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-25 14:36:56
那么根据marker也可以估计出来大致浓度。总之20ul体系里面的DNA最好不要超过1ug，绝对不要超过2ug，否则酶切很难完全。...

我也知道，关键是估计浓度本人没经验，所以加的量也就不准了。
另外，我的体系是50ul.
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16楼2013-01-25 16:10:06
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liurz

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-25 14:46:45
从胶上定量也需要你的带与marker相应的带亮度差不多啊，你的这个用眼睛直接估计有些难度。按照你的估计700ng是上了多少ul？
虽然不知道你的PCR扩增效率和回收效率，总之不一定要都切了吧。酶切后的一般是做连接， ...

我准备下次稀释5倍上样，尽量使亮度相当，这样才好估计。
第一次做这些实验，总感觉目的基因与质粒的比例越大越好，所以就尽量多切些目的基因。另外对浓度估计也不准，所以结果就这样了。
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17楼2013-01-25 16:13:39
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liurz

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-25 14:46:45
从胶上定量也需要你的带与marker相应的带亮度差不多啊，你的这个用眼睛直接估计有些难度。按照你的估计700ng是上了多少ul？
虽然不知道你的PCR扩增效率和回收效率，总之不一定要都切了吧。酶切后的一般是做连接， ...

即使没有酶切完全，也不应该条带比原来还大吧，也应该位置一样啊，我只是酶切下来10个碱基左右，也不应该拖尾啊。
还有人说我的酶和目的基因结合造成的拖尾，不知什么原因哪。
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18楼2013-01-25 16:21:09
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haitian0625

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同意2楼说法，酶切貌似不完全，不过你酶量加的很多了，不知多少浓度的酶，按照NEB官网，你的酶量已经在20U左右了。还是再尝试延长酶切时间吧。弱弱的问下，你双酶切后没小片段，双酶离得很近？
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19楼2013-01-25 18:48:21
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haitian0625

金虫 (小有名气)
没看第二页不好意思。。。。
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20楼2013-01-25 18:49:29
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